基于高效液相色譜-三重四極桿質譜技術測定荔枝和香蕉中的草銨膦及3種代謝物

王思威, 曾廣豐, 劉艷萍, 王瀟楠, 孫海濱*

(1. 廣東省農業科學院植物保護研究所, 廣東省植物保護新技術重點實驗室, 廣東 廣州 510640;2. 廣東省出入境檢疫檢驗局檢驗檢疫技術中心, 廣東 廣州 510623)

草銨膦(glufosinate-ammonium, GA)是德國赫斯特公司開發的廣譜、觸殺型滅生性有機磷類除草劑,其除草作用機理為特異性地抑制植物的谷氨酰胺合成酶活性,導致植物體內氮代謝紊亂,過量累積銨,從而使葉綠體解體、光合作用受到抑制導致死亡[1,2]。由于雜草對草銨膦不易產生抗藥性,這促使草銨膦的銷售量激增。草銨膦的主要代謝產物為3-(甲基膦基)丙酸(3-methylphosphinico-propionic acid, MPP)、2-(甲基膦基)乙酸(2-methylphosphinico-acetic acid, MPA)和N-乙酰草銨磷(N-acetyl-glufosinate, NAG)(結構式見圖1)。已有研究表明草銨膦在急性劑量水平下可對人體產生有害影響[3],低劑量水平下對人體的慢性影響暫不清楚[4];草銨膦對人體的生殖系統會產生毒性,其代謝產物也為有毒物質,對人類健康存在一定的風險性[5,6]; JMPR(Joint FAO/WHO Meeting on Pesticide Residues)報告中顯示,山羊、蛋雞飼喂含草銨膦的飼料后,在羊奶、雞蛋、組織和排泄物中的主要殘留成分為草銨膦游離酸(glufosinate), glufosinate再代謝為MPP和少量的NAG、MPA[7]。因此,開展草銨膦及代謝產物在不同基質中的分析方法研究十分必要。

圖 1 草銨膦及其代謝物的化學結構式Fig. 1 Chemical structures of glufosinate-ammonium and its metabolites

目前,關于草銨膦的研究仍主要集中于母體[8-16],其代謝產物MPP和NAG的分析方法較少[6],暫未發現MPA的相關報道。

由于草銨膦及其代謝物具有低揮發性、高水溶性、缺乏紫外生色團以及結構上存在陰離子等特性,故氣相色譜和液相色譜很難直接檢測[16]。Royer等[17]通過預先采用三氟乙酸酐等作為衍生劑將草銨膦衍生,然后采用GC-MS檢測;See等[18]采用在線毛細管電泳結合電容耦合非接觸電導檢測草銨膦;Chang等[19]首先用9-芴基氯甲酸甲酯對草銨膦進行柱前衍生,毛細管電泳分離,紫外檢測器檢測草銨膦衍生物;Kusters和Gerhartz[20]采用液相色譜-熒光檢測器用9-芴基氯甲酸甲酯對草銨膦進行柱前衍生后測定草銨膦殘留。國內有關草銨膦母體的分析方法主要為固相萃取小柱凈化-衍生-HPLC(UPLC)-MS/MS檢測,過濾柱凈化-離子色譜(IC)檢測,固相萃取小柱凈化-毛細管電泳(CE)紫外檢測法等,代謝物MPP和NAG主要采用堿液提取后HPLC-MS/MS直接進樣分析,其中MPP采用毛細管電泳-紫外檢測結合固相萃取小柱進行分析[8-16]。

歐盟規定草銨膦的殘留定義為glufosinate及其鹽、MPP和NAG之和;日本對glufosinate的殘留定義為glufosinate、MPP和NAG之和;CAC(Codex Alimentarius Commission)規定草銨膦殘留定義為草銨膦、MPP和NAG之和;中國GB 2763-2016上規定草銨膦的殘留定義僅為草銨膦。歐盟、日本和CAC規定草銨膦在荔枝、香蕉、芒果等水果中的最大殘留限量值(MRLs)為0.1～0.2 mg/kg[21-23],我國僅規定了草銨膦在香蕉、柑橘和番木瓜3種水果中的MRLs值(0.2～0.5 mg/kg),且均為臨時限量[24]。因此,通過建立草銨膦及其3種代謝物在水果中的分析方法,可為草銨膦在上述水果中的殘留試驗提供方法參考,為殘留限量的制定提供保障,同時為市場上草銨膦及代謝物的殘留水平監測提供方法依托。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

AB SCIEX 4000Q三重四極桿質譜儀,配電噴霧離子源(ESI)(美國AB SCIEX公司); Agilent LC-1200高效液相色譜儀(美國安捷倫公司); Milli-Q超純水機(美國Millipore公司); GTR22-1離心機(北京時代北利離心機有限公司); OA-SYS氮吹儀(美國); XW-80A渦旋儀(上海精科有限公司)。

乙腈和甲醇(色譜純,美國Fisher公司);甲酸和氨水(色譜純,美國Fluka公司);草銨膦標準品(99.2%,德國Ehrenstorfer公司); MPP、MPA、NAG標準品(純度97.9%、99.4%、96.2%,德國Ehrenstorfer公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1樣品處理

分別稱取荔枝和香蕉樣品5.0 g,置入50 mL離心管中,加入10 mL水進行提取,勻漿1 min,超聲30 min后,10 000 r/min離心10 min。取2 mL上清液,旋轉蒸發儀45 ℃濃縮至約50 μL,氮吹至近干,用含0.1%(v/v)氨水的甲醇定容至1 mL,過0.22 μm濾膜,待測。

1.2.2色譜-質譜條件

色譜條件 色譜柱為Agilent Extend-C18(150 mm×3.0 mm, 3.5 μm);流動相為0.1%(v/v)氨水-甲醇(9∶1, v/v),運行5 min;流速0.5 mL/min;柱溫35 ℃;進樣量10 μL。

質譜條件 ESI-,多反應監測模式,離子源溫度450 ℃,氣簾氣壓力206.85 kPa(30 psi),毛細管電壓4 500 V,霧化氣壓力344.75 kPa(50 psi)。其他相關參數見表1。

表 1 草銨膦及3種代謝物的質譜參數Table 1 MS parameters of GA and its three metabolites

2 結果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

由于草銨膦及其代謝物均為水溶性,因此考察了1%(v/v,下同)甲酸甲醇-水(2∶1, v/v)、1%甲酸水溶液和水3種提取劑時對草銨膦及其3種代謝物的提取效率。結果顯示,1%甲酸甲醇-水(2∶1, v/v)和1%甲酸水溶液作為提取溶劑時草銨膦及其代謝物的提取率均在40%以下,而水作為提取溶劑的提取率均在80%以上。因此,本研究選擇水作為提取溶劑(見圖2)。

圖 2 3種提取溶劑對草銨膦及其代謝物的提取效果(n=3)Fig. 2 Extraction efficiencies of three solvents for GA and its metabolites (n=3)

2.2 儀器條件優化

2.2.1色譜柱的選擇

考察了Poroshell-120 EC-C18(150 mm×3.0 mm, 2.7 μm)、Poroshell-120 EC-C18(100 mm×2.1 mm, 2.7 μm)、XBridge C18(100 mm×2.1 mm, 3.5 μm)、Atlantis T3(100 mm×3.0 mm, 3.0 μm)、Extend C18(150 mm×3.0 mm, 3.5 μm)等5種色譜柱在不同流動相體系(乙腈-甲酸水和乙腈-氨水)下對4種目標物的分離能力。如圖3所示:5種色譜柱在乙腈-0.1%甲酸水等度洗脫流動相體系(1∶9, v/v)的峰形對稱性差,色譜峰拖尾嚴重,可能由于目標物酸性太強,在酸性流動相體系中與色譜柱作用力太強所致。因此改用氨水體系作為流動相。在堿性流動相體系下,上述5款色譜柱中,只有Extend C18(150 mm×3.0 mm, 3.5 μm)的固定相能耐受堿性流動相,且草銨膦及3種代謝物的峰形對稱性和響應均良好,可用于本研究檢測分析。

圖 3 5種不同色譜柱對草銨膦及代謝物的色譜分離圖Fig. 3 Chromatograms of GA and its metabolites on five different chromatographic columns Mobile phase: 0.1% formic acid aqueous solution-acetonitrile (9∶1, v/v).

圖 4 采用不同流動相時草銨膦及代謝物的色譜圖Fig. 4 Chromatograms of GA and its metabolites with different mobile phases

2.2.2流動相的選擇

考察了乙腈和甲醇兩種有機相分別與氨水組合形成的流動相體系對草銨膦及3種代謝物的洗脫效果。結果如圖4所示:有機相選用乙腈時,4種目標物的峰形出現峰展寬、不對稱等現象,影響定量分析結果。使用甲醇-氨水作為流動相時,氨水的加入可使目標物峰形對稱和峰寬更窄,并促成[M-H]-離子峰的形成,以[M-H]-作為母離子能夠獲取高強度的離子碎片,增強草銨膦及3種代謝物的響應值,提高檢測分析的靈敏度。草銨膦是一種含有氨基的堿性農藥,其他3種代謝物含有-COOH或-POOH基團,均具有較強的水溶性,需要流動相中水的含量較高,參考文獻[6,11]選擇流動相為0.1%氨水-甲醇(9∶1, v/v),能夠保證草銨膦和3種代謝物的高響應值。因此,本研究選擇0.1%氨水-甲醇(9∶1, v/v)作為流動相。

2.2.3質譜條件的優化

采用正負離子掃描模式對4種目標物進行了分析,發現目標物在ESI負離子模式下響應強度更高,分子離子峰均為[M-H]-形式。因此,在負離子掃描模式下確定了草銨膦及MPP、MPA和NAG的母離子分別為m/z180.0、150.9、136.9、222.0。為提高目標化合物的離子化效率,進而提高靈敏度,對源內參數(去簇電壓(DP)、碰撞能量(CE)等)進行了優化。采用針泵進樣的方式,優化去簇電壓,在二級質譜中選擇母離子響應強度最高、干擾最少的2個子離子作為定性和定量離子;在MRM模式下,對子離子的CE進行了優化,優化結果見表1。

2.3 基質效應的考察

考察了草銨膦及3種代謝物在純溶劑及荔枝、香蕉基質中的響應情況。用0.1%氨水-甲醇(9∶1, v/v)溶液配制草銨膦及代謝物的系列標準混合溶液,同時,按照1.2.1的前處理方法,制備空白荔枝和香蕉基質溶液,用來配制與上述溶劑同濃度水平的系列基質匹配標準溶液。以基質匹配標準曲線的斜率與溶劑曲線斜率的比值評價基質效應,比值大于1,表現為基質增強效應,比值小于1則為基質抑制效應。實驗結果表明,荔枝和香蕉樣品均表現為強烈的基質抑制作用(見表2)。因此,本研究采用基質匹配標準溶液來校正基質抑制效應,從而確保研究結果的準確性和可靠性。

2.4 方法的線性范圍及檢出限

在1～1 000 μg/L范圍內,以基質匹配標準溶液的進樣濃度為橫坐標,所對應的響應值為縱坐標作圖,經最小二乘法得草銨膦、MPA、MPP及NAG基質匹配標準溶液線性方程(見表2),結果表明,線性關系良好。

以3倍和10倍信噪比(S/N)確定方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ),具體結果見表2。

表 2 草銨膦及其代謝物的溶劑、基質匹配標準溶液的線性方程、相關系數、斜率比值、檢出限及定量限Table 2 Linear equations, correlation coefficients and slope ratios, limits of detection (LODs), limits of quantification (LOQs) of GA and its metabolites in the solvent and matrices

y: peak area;x: mass concentration, μg/L.

2.5 回收率試驗

對市場上抽測的5個荔枝和香蕉樣品進行檢測,均未檢出草銨膦及其代謝物。在50、100、1 000 μg/kg 3個添加水平下,草銨膦及3種代謝物在荔枝和香蕉中的平均添加回收率為82.9%～98.6%,相對標準偏差(RSD)為2.6%～6.3%(見表3和圖5)。方法的回收率和RSD范圍符合殘留分析檢測要求[25]。

表 3 草銨膦及代謝物在荔枝、香蕉樣品中的添加回收率和RSD(n=5)Table 3 Recoveries and RSDs of GA and its metabolites spiked in litchi and banana (n=5)

圖 5 草銨膦和3種代謝物的標準溶液、荔枝和香蕉空白樣品及加標(100 μg/kg)樣品的色譜圖Fig. 5 Chromatograms of a mixture of GA and its metabolite standards, blank and spiked samples of litchi and banana (100 μg/kg)

3 結論

本文建立了應用HPLC-MS/MS方法檢測荔枝和香蕉中草銨膦及3種代謝物殘留水平的分析方法,前處理方法操作簡便、快速,儀器靈敏度高,適于批量樣品的快速分析,可應用于市場抽檢樣品中草銨膦及其代謝物的快速監測。