γ-Al2O3-氧化石墨烯吸附材料用于尿液中核苷的檢測

侯星羽, 黃 瑋, 佟育奎, 朱富貴, 田苗苗

(黑龍江省光化學生物材料與儲能材料重點實驗室, 哈爾濱師范大學化學化工學院, 黑龍江 哈爾濱 150025)

核苷作為核酸的主要組分,不僅參與DNA和RNA的生物合成,還參與控制和管理人體多種生理過程,呈現多種生物活性,是生物細胞維持生命的重要物質,具有免疫調節、改善腦細胞代謝、鎮靜中樞神經等多種藥理生理活性[1,2]。如肌苷可治療急、慢性肝炎及風濕性心臟病;胞苷可作為升高白細胞的藥物;尿苷對治療肝、腦血管、心血管等疾病有重要功效等。人體尿液中化學成分十分復雜,相對于其他成分而言,核苷含量較低,在分析過程中容易受到干擾而影響檢測結果的準確度。能夠實現對核苷組分有效分離和正確鑒別的高靈敏度和高選擇性的定量檢測方法是研究核苷應用的關鍵。

近年來已開發幾種色譜方法用于分析尿液中的核苷,如:高效液相色譜(HPLC)法[3]、液相色譜-質譜(LC-MS)法[4,5]、毛細管電泳與紫外檢測(CE-UV)法[6]等。常用的預濃縮技術有固相萃取(SPE)技術、液相微萃取、固相微萃取、濁點萃取等,由于SPE具有回收率高、萃取時間短、富集系數高、有機溶劑消耗量少、成本低、易于操作等特點而成為最廣泛使用的預濃縮方法[7,8]。隨著新型待測物的不斷涌現,SPE所用的吸附劑也得到了相應的發展。氧化石墨烯(GO)材料由于其超大的比表面積和豐富的含氧基團(羧基、羥基和環氧基),通過氫鍵等分子間作用力實現對不同化合物的吸附,成為理想的吸附材料[9,10]。研究者們[11,12]憑借著其表面官能團的可修飾性,在GO的基礎上研發出了眾多的GO復合吸附材料,賦予其新的性質,進一步拓展其應用領域。因GO容易團聚,在水溶液中分散性差,為有效阻止本身的團聚現象,可在其表面具有的豐富含氧基團上鍵合納米氧化物。納米氧化物是目前生產、使用最為廣泛的納米材料,包括二氧化鈦、鐵氧化物、氧化硅以及氧化鋁等,由于納米氧化物具有較大的比表面積和反應活性,使其成為一種理想的吸附材料。其中γ-Al2O3納米粒子是一種孔徑均勻的多孔材料,有著比表面積大、孔隙率高、吸附能力較強及在多種有機溶劑中良好的分散性等優點[13],γ-Al2O3納米粒子表面的羥基可以與GO表面的含氧基團發生反應。本文以GO為載體,在其表面鍵合γ-Al2O3納米粒子,合成了γ-Al2O3-GO吸附劑。由于兼具γ-Al2O3和GO的優點,可提高γ-Al2O3-GO吸附劑的吸附能力,具有很好的穩定性,便于應用在分析等領域。

本文將γ-Al2O3-GO作為吸附劑,考察了影響SPE的各種因素。在最佳萃取條件下,對人體尿液中的核苷類物質進行預富集,并結合高效液相色譜技術進行分析測定,在9 min內完成了4種核苷的快速分離檢測。對γ-Al2O3-GO吸附劑進行了透射電鏡、熱重分析及紅外光譜等表征,考察了其對4種核苷檢測的線性范圍、檢出限、穩定性、重復性等性能,并系統地研究了該吸附劑的吸附效果,使用新制備的γ-Al2O3-GO作為SPE吸附劑從復雜基質中富集目標分析物。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

LC-20AT型高效液相色譜儀配有LC-20AT流動相輸液泵、SIL-20A自動進樣器、CTO-20A色譜柱柱溫箱、SPD-20A紫外檢測器和LabSolutions工作站(日本Shimadzu公司)。色譜柱為反相色譜柱(Diamonsil C18, 250 mm×4.6 mm, 5 μm,美國Thermo Fisher公司)。ASE-12固相萃取儀(天津奧特賽恩斯儀器公司); SPE空柱(天津天豪儀器公司); JSM 2000-F透射電子顯微鏡(日本JEOL公司); TENSORⅡ紅外光譜儀(德國Bruker儀器公司); Q500熱重分析儀(美國TA公司); pH-10型酸度計(北京賽多利斯科學儀器公司); Milli-Q SP型純水系統(美國Millipore公司); JJ-1磁力電動攪拌器(金壇市江南儀器廠); ZK-82BB真空干燥箱(上海實驗儀器有限公司); LD5-2A離心機(北京京立儀器公司); 0.45 μm有機相濾膜(上海阿拉丁化學試劑有限公司)。

標準品(胞苷、尿苷、肌苷、鳥苷,純度均≥98%,上海阿拉丁化學試劑有限公司);乙醇(EtOH)、甲醇(MeOH)、三氟乙酸(TFA)、乙腈(ACN)、NaH2PO4、H3PO4、NaOH(均為分析純,北京化工廠);石墨粉(純度99.95%)、γ-Al2O3(純度99.9%)、石英砂(粒度150 μm)(上海國藥集團化學試劑有限公司);MeOH(色譜純,美國Fisher Scientific公司)。

1.2 溶液配制

稱取一定量的上述4種標準品(胞苷、尿苷、肌苷、鳥苷),用去離子水(DDW)進行稀釋,配制成100 mg/L的標準儲備液,置于4 ℃冰箱中密封保存備用。稱取一定質量的NaH2PO4配制成0.02 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液,并用H3PO4和NaOH調節溶液的pH值。

1.3 色譜條件

流動相A為H2O,流動相B為MeOH,在使用之前,流動相需經0.45 μm濾膜過濾并脫氣30 min。使用MeOH/H2O(1∶9, v/v)等度洗脫;流速:0.9 mL/min;紫外檢測波長:260 nm;柱溫:35 ℃;進樣量:10 μL。

1.4 γ-Al2O3-GO吸附劑的制備

利用Hummers氧化法[14]合成GO。具體操作如下:將一定量的石墨粉和NaNO3在電動攪拌的作用下緩慢加入到濃H2SO4中,攪拌均勻后,向混合物中加入一定量的KMnO4, 35 ℃恒溫水浴并攪拌30 min。緩慢加入DDW稀釋,用10%(體積分數,下同)的H2O2還原剩余的KMnO4,最后趁熱離心去除上層清液,再用10%的HCl離心洗滌,以去除金屬離子,接著用DDW去除酸,70 ℃下水浴干燥,即可得到片狀的GO。

將100 mg GO加入到10 mL EtOH中,超聲分散1 h,得到10 g/L GO-EtOH分散液。分別將10、20和30 mg的γ-Al2O3納米粒子加入到上述3份GO-EtOH分散液中,制備不同γ-Al2O3/GO重量比的吸附劑。將3份混合物繼續超聲處理30 min,最后在電磁攪拌的作用下于70 ℃水浴中干燥、研磨,即可得到γ-Al2O3-GO吸附劑。制備過程見圖1。

圖 1 γ-Al2O3-GO吸附劑合成示意圖Fig. 1 Schema of the preparation of the γ-Al2O3-GO absorbentEtOH: ethanol.

1.5 SPE柱的制備

將3 mL SPE柱、上下聚乙烯(PE)篩板用0.10 mmol/L HCl溶液浸泡24 h,再用DDW進行多次洗滌。干燥后,分別稱取0.10 gγ-Al2O3-GO和0.10 g石英砂混合物填入SPE空柱中,柱子的兩端用PE篩板蓋實,即制得SPE柱。

1.6 SPE步驟

SPE柱分別用2 mL MeOH和2 mL DDW活化,將2 mL樣品溶液上樣到活化好的SPE柱,利用γ-Al2O3-GO SPE柱富集樣品中的胞苷、尿苷、肌苷、鳥苷,富集后用磷酸鹽緩沖溶液沖洗多余雜質,負壓抽干。最后,選用0.5 mL含1%TFA的ACN/H2O (3∶7, v/v)洗脫萃取柱上的核苷類物質,收集洗脫液,經0.45 μm濾膜過濾,采用HPLC進行分析檢測。

2 結果與討論

2.1 γ-Al2O3-GO吸附劑的表征

2.1.1透射電鏡

GO和γ-Al2O3-GO的形貌和大小使用透射電鏡(TEM)表征。圖2a為GO的TEM圖,由圖中可知,GO表面光滑,沒有顆粒物存在,而且顏色與基底銅網上碳膜顏色非常接近,說明所得到的氧化石墨烯是非常薄的片狀結構。圖2b～d分別為γ-Al2O3加入量為10、20和30 mg時γ-Al2O3-GO吸附劑的TEM圖。從圖2b和2c中可以看到許多非常細小的顆粒物,這些顆粒物都均勻地分布在氧化石墨烯表面。圖2d表明,當γ-Al2O3的加入量為30 mg時,吸附劑的均勻程度降低,并發生聚集現象,但出于對萃取效率的考慮,過少的加入量會導致萃取效率下降,最終選取20 mgγ-Al2O3為最佳加入量。當γ-Al2O3加入量為20 mg時,吸附劑表面顆粒分布均勻,說明γ-Al2O3和GO成功復合在一起。后續實驗均選用γ-Al2O3加入量為20 mg。

圖 2 (a)GO和γ-Al2O3加入量分別為(b)10、 (c)20和(d)30 mg時γ-Al2O3-GO吸附劑的透射電鏡圖 Fig. 2 Transmission electron microscopy (TEM) images of (a) graphene oxide (GO)and the γ-Al2O3-GO absorbent comprising (b) 10, (c) 20, and (d) 30 mg γ-Al2O3

2.1.2紅外光譜分析

從圖3a中可以看出,γ-Al2O3-GO吸附劑的紅外光譜在3 410、1 621、1 020以及620 cm-1處有較強的吸收峰。其中3 410 cm-1處的吸收峰對應GO的-OH峰、-COOH峰和γ-Al2O3的H2O峰;1 725 cm-1處的吸收峰是GO邊緣羧基、羰基中的C = O的伸縮振動;1 621 cm-1處的強吸收峰對應γ-Al2O3的懸掛鍵和GO的C = C振動峰;1 340 cm-1處的特征峰為GO的環氧基(C-O-C)[15]; 1 020 cm-1處吸收峰可能來自于γ-Al2O3上γ-OH的彎曲振動;620 cm-1處的吸收峰可能歸因于Al-O的伸縮振動。以上這些特征吸收峰的出現說明成功地制備了γ-Al2O3-GO吸附劑。

2.1.3熱重分析

圖3b是γ-Al2O3-GO吸附劑的熱重分析(TGA)曲線,從圖中可知,100 ℃之前,材料幾乎沒有重量損失;100～250 ℃的失重主要是由于吸附劑表面的水分子或有機小分子化合物的揮發;250～600 ℃吸附劑發生明顯的重量損失;當溫度高于750 ℃時,TGA曲線趨于平衡。說明合成的γ-Al2O3-GO吸附劑熱穩定性良好。

圖 3 (a)GO和γ-Al2O3-GO吸附劑的傅里葉紅外吸收圖譜及 (b)γ-Al2O3-GO吸附劑的熱重分析曲線Fig. 3 (a) Fourier transform infrared spectroscopy (FT- IR) spectra of GO and γ-Al2O3-GO absorbent, and (b) thermal gravimetric analysis (TGA) curve of γ-Al2O3-GO absorbent

2.2 吸附性能

將2 mL 1 mg/L的核苷(胞苷、尿苷、肌苷、鳥苷)混合樣品溶液加入γ-Al2O3-GO SPE柱中,收集洗脫液,將清液用0.45 μm濾膜過濾后,用HPLC分析檢測其濃度。用公式(1)評價吸附劑的吸附能力:

(1)

式中Qe代表吸附量(μg/g),C0和C1分別為目標分析物在水樣中的初始濃度(mg/L)和經SPE吸附后的質量濃度(mg/L),V為樣品體積(mL),m為γ-Al2O3-GO吸附劑的用量(g)。

2.3 實驗參數的優化

2.3.1洗脫液種類優化

根據被測物質的極性優化洗脫液的種類。分別以含1%TFA的MeOH/H2O(3∶7, v/v)、MeOH/H2O(9∶1, v/v)、MeOH、含1%TFA或3%TFA或5%TFA的ACN/H2O(3∶7, v/v)為洗脫液,比較各種洗脫液對核苷的洗脫效果,結果如圖4a所示。通過計算其回收率,含1%TFA的ACN/H2O(3∶7, v/v)具有較好的洗脫效果。由于TFA可以和目標分析物發生親水作用,因此,后續試驗選取含1%TFA的ACN/H2O(3∶7, v/v)作為洗脫液。

2.3.2γ-Al2O3-GO吸附劑用量的優化

考察了填充在SPE柱中的γ-Al2O3-GO吸附劑用量對實驗結果的影響。為確保SPE柱填料的均勻性,增大SPE柱的滲透性,采用石英砂與吸附劑混合裝柱,與未加石英砂的吸附柱相比,γ-Al2O3-GO吸附劑填充的更加均勻緊密,凈化效果更好。將0.05、0.08、0.10、0.12和0.15 gγ-Al2O3-GO吸附劑分別與0.10 g石英砂均勻混合后填充在SPE柱中,對核苷進行吸附,結果如圖4b所示,當吸附劑用量為0.10 g時,吸附量達到最高。隨著吸附劑用量的增加,吸附量有所下降且逐漸達到平衡。因此,選擇γ-Al2O3-GO吸附劑的用量為0.10 g。

2.3.3樣品體積的優化

從圖4c可以看出,當樣品體積為0.5、1.0、1.5、2.0 mL時,隨著體積的增加,吸附量逐漸增大,但當樣品體積大于2.0 mL時,由于SPE柱對核苷基本吸附完全,吸附量值無明顯變化。并且樣品體積過大,將導致分析時間延長。所以,選擇樣品體積為2.0 mL。

圖 4 (a)洗脫液種類、(b)吸附劑用量、(c)樣品體 積和(d)樣品pH值的優化(n=3)Fig. 4 Optimization of (a) eluent type, (b) absorbent amount, (c) sample volume, and (d) sample pH (n=3) TFA: trifluoroacetic acid; MeOH: methanol; ACN: acetonitrile; Q: absorbent amount.

2.3.4樣品pH值的優化

樣品pH值是影響吸附效率的一個重要因素,本試驗研究了樣品pH在5.0～11.0范圍內對吸附效率的影響,結果(見圖4d)表明,核苷的吸附量在pH為10.0時達到最大值。可能是因為核苷表面的羧基與γ-Al2O3-GO吸附劑中GO表面的羧基及γ-Al2O3表面的羥基形成氫鍵作用,且存在靜電作用。當pH小于10.0時,隨著pH的下降,γ-Al2O3-GO吸附劑與核苷之間的氫鍵和靜電作用逐漸減小,所以吸附效率減低。而pH過高也不利于吸附,所以本試驗選擇的最佳pH值為10.0。

2.4 方法評價及實際樣品分析

2.4.1方法評價

在上述優化的實驗條件(γ-Al2O3-GO吸附劑用量0.10 g、樣品體積2.0 mL、pH 10.0)下,采用γ-Al2O3-GO SPE柱對核苷進行萃取、洗脫和檢測。由于基質效應的影響,可能會導致待測物發生抑制作用,本試驗在實際樣品分析前,采用基質加標法,得到工作曲線。稱取相同基質的空白樣品,分別加入不同體積的標準儲備液,用加標空白實際樣品經萃取洗脫后的濃度與對應的色譜峰面積,建立了4種核苷類物質的工作曲線。結果如表1所示,曲線的線性范圍在不同質量濃度水平(胞苷、肌苷、鳥苷為0.10～10 mg/L,尿苷為0.05～10 mg/L)下具有較好的線性關系,相關系數(R2)為0.996 7～0.997 3。檢出限(LOD)和定量限(LOQ)分別以信噪比的3倍和10倍計算,分別為0.010～0.021和0.033～0.070 mg/L。在測量次數均為3次時,方法的日內和日間(連續3 d)精密度分別為0.1%～0.8%和1.0%～3.1%,說明該方法具有良好的重現性。

表 1 γ-Al2O3-GO吸附劑對4種核苷的線性范圍、R2、檢出限、定量限和相對標準偏差(n=3)Table 1 Linear ranges, correlation coefficients (R2), limits of detection (LOD), limits of quantification (LOQ) and RSDs of γ-Al2O3-GO absorbent of the four nucleosides (n=3)

為了進一步說明γ-Al2O3-GO作為一種新型吸附劑應用于SPE-HPLC方法檢測的優點,將該方法得到的檢出限和定量限等與其他在不同實際樣品基質中檢測核苷的方法[3,16-20]進行了比較,結果見表2。從表中可見,本方法具有相對較低的LOD和LOQ。另外,相比之下,本方法應用的γ-Al2O3-GO SPE-HPLC檢測具有簡便、省時、成本低等優點。

表 2 比較測定核苷類物質的不同樣品前處理技術和檢測方法Table 2 Comparison of different sample preconcentrations and detection methods for the determination of nucleosides

表 2 (續)Table 2 (Continued)

DSPE: dispersive solid-phase extraction; MSPD: matrix solid-phase dispersion extraction; ND: not detected.

圖 5 4種核苷經γ-Al2O3-GO吸附劑 富集前后的HPLC峰面積對比Fig. 5 Comparison of the HPLC peak areas of the four nucleosides before and after the enrichment with γ-Al2O3-GO absorbent

圖 6 γ-Al2O3-GO SPE-HPLC方法獲得的尿液樣品色譜圖Fig. 6 Chromatograms of urinary samples obtained by the γ-Al2O3-GO SPE-HPLC method a. blank sample; b. sample spiked with 0.5 mg/L mixed standard solution; c. sample spiked with 1.0 mg/L mixed standard solution; d. sample spiked with 2.0 μg/mL mixed standard solution.

2.4.2對比研究

在最優化的實驗條件下,對比了4種核苷類物質沒有經過富集直接經HPLC分析得到的峰面積與采用γ-Al2O3-GO作為吸附劑富集核苷后再進行HPLC分析所得到的峰面積。結果(見圖5)表明,經過富集后的核苷峰面積響應值明顯高于富集前。表明γ-Al2O3-GO吸附劑對核苷具有一定的富集能力。可能有以下原因:首先,GO具有較大的比表面積,豐富的π-π共軛鍵,表面所含的羥基、羧基和環氧基團可以通過氫鍵作用來提高對分析物的吸附能力。其次,GO不易溶于水,在水溶性溶液中易發生聚集,不利于分離,這降低了GO的萃取效率,γ-Al2O3-GO吸附劑可以在萃取過程中保持GO的片層結構,同時,γ-Al2O3表面的親水基團使其對水溶液中分析物的萃取效率大大提高。最后,核苷中的羥基或氨基與γ-Al2O3納米粒子的羥基(γ-Al2O3納米粒子在質子溶液中會形成羥基[13])形成氫鍵。從而提高改性吸附劑對目標分析物的吸附能力。

2.4.3實際樣品檢測

選取5個正常人的臨床尿液樣本檢測胞苷、尿苷、肌苷和鳥苷的含量。將尿液樣本用pH為7.0的磷酸鹽緩沖溶液稀釋10倍,置于離心管中。在SPE-HPLC操作前,所有稀釋后的尿液都需用0.45 μm濾膜過濾除雜。使用該方法對5個尿液樣本進行加標回收率的測定(加標值分別為0.5、1.0和2.0 mg/L),實際樣品1的色譜圖和其加標色譜圖見圖6。實際樣品中4種核苷的含量以及加標回收率的分析結果見表3。表中數據為3次測定的平均值,加標回收率為71.3%～107.4%,相對標準偏差不大于4.8%。結果表明,該方法適用于尿液中核苷含量的檢測,有效避免了基質的影響,并對分離和富集實際樣品中低濃度的核苷類化合物提供了一定的理論依據。

3 結論

本實驗成功地制備了γ-Al2O3-GO新型吸附劑,γ-Al2O3納米顆粒的親水表面增強了該吸附劑在水溶性樣品中的分散,避免了石墨烯片層在水溶液中發生不可逆的團聚,提高了對目標物的萃取率。將該材料作為SPE吸附劑結合HPLC檢測手段,在最優的實驗條件下,考察了該方法對核苷的富集能力和回收率,建立了富集與檢測人體尿液樣品中核苷類物質的方法。其結果令人滿意,為進一步分析研究核苷類物質提供了新的途徑和方法。