液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測雄蜂蛹粉中50種抗生素殘留

楊雯筌, 張曉燕*, 姚 倩, 周楊娟, 胡亞文, 王茂華, 唐茂芝

(1. 南京海關(guān)動植物與食品檢測中心, 江蘇 南京 210001; 2. 東南大學(xué)成賢學(xué)院, 江蘇 南京 210088; 3. 國家認(rèn)證認(rèn)可監(jiān)督管理委員會認(rèn)證認(rèn)可技術(shù)研究所, 北京 100020)

蜜蜂在生長過程中可能會被各種幼蟲病困擾,因此養(yǎng)蜂者常使用一些抗生素來控制幼蟲病[1],國外允許使用的抗生素有紅霉素[2]、磺胺類藥物[3]、林可霉素[4]、泰樂菌素[4]和四環(huán)素類藥物[5]等,我國除了上述藥物,還會使用喹諾酮類藥物[6]。由于近幾年極端氣候的影響以及養(yǎng)蜂者缺乏科學(xué)的用藥知識,再加上對蜂藥監(jiān)管的相對薄弱,蜂產(chǎn)品中抗生素超標(biāo)現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生[7]。蜂產(chǎn)品中抗生素的殘留引發(fā)人類急性中毒的可能性很小,但長期低劑量攝入,可能會產(chǎn)生慢性和積蓄性的毒性,如“三致毒性”(致癌、致畸、致突變)和免疫毒性等,其對健康和環(huán)境的危害具有隱蔽性,易造成實(shí)質(zhì)性和難以逆轉(zhuǎn)的危害[8]。

雄蜂蛹粉作為蜂蜜、蜂王漿之后的第三代蜂產(chǎn)品,具有高蛋白、低脂肪的特點(diǎn)。我國蜂蛹資源豐富,在湖北、四川、安徽等多地已開發(fā)出雄蜂蛹粉產(chǎn)品[9-11],國內(nèi)外市場對其需求量也逐漸增加。但我國蜂產(chǎn)品仍然存在抗生素殘留的問題,歐盟、日本、美國等都提高了從我國進(jìn)口蜂產(chǎn)品時(shí)藥物殘留的質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)。目前我國還沒有適用于雄蜂蛹粉中抗生素檢測的方法,限制了雄蜂蛹粉出口市場的發(fā)展。因此建立簡便有效的檢測方法迫在眉睫。

檢測抗生素的方法有微生物法[12]、酶聯(lián)免疫法[13]、氣相色譜-質(zhì)譜法[14]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[15-19]等。微生物法簡單快速,成本低,但特異性差,易受其他抗生素影響,且靈敏度不高。酶聯(lián)免疫法雖具有靈敏度高、前處理簡單、測定速度快等特點(diǎn),但檢測結(jié)果存在假陽性現(xiàn)象,且不適用于多類藥物殘留的同時(shí)檢測。多種抗生素的高通量檢測也是目前檢測方法的發(fā)展方向之一[20,21],目前常用的測定方法為液相色譜-質(zhì)譜法和氣相色譜-質(zhì)譜法,由于氣相色譜-質(zhì)譜法存在前處理步驟繁瑣,有機(jī)試劑消耗量大,測定周期長等缺點(diǎn)[22],因此本文采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法,選擇蜂產(chǎn)品中常見的抗生素種類,并針對雄蜂蛹粉蛋白質(zhì)含量高的特點(diǎn),采用混合蛋白沉淀劑凈化提取液,最終建立了雄蜂蛹粉中大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類、磺胺類、四環(huán)素類、硝基咪唑類、林可霉素和氯霉素等50種抗生素殘留的檢測方法,具有操作簡便、靈敏度高、回收率穩(wěn)定、測定周期短等優(yōu)點(diǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

TSQ Vantage三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀,配Surveyor液相色譜系統(tǒng)(美國Thermo公司); XW-80A渦旋混勻器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠); 2-16K離心機(jī)(美國Sigma公司); AutoVAP S60氮吹儀(美國ATR公司); Smart-N15VF超純水器(上海力康公司); SPE-432全自動固相萃取儀(北京普立泰科公司); OASIS HLB固相萃取柱(60 mg/3 mL,美國Waters公司)

甲醇、甲酸(以上為色譜純)、醋酸、三水合磷酸氫二鉀、三水合乙酸鉛(以上為分析純)、高氯酸(優(yōu)級純)和50種抗生素標(biāo)準(zhǔn)品(純度98%～99%)均購自德國Dr. Ehrenstorfer公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液:準(zhǔn)確稱取適量的標(biāo)準(zhǔn)品,分別用甲醇配制成1.0 g/L的50種抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液(喹諾酮類抗生素,加入100 μL 0.5 mol/L NaOH溶液助溶)。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液:準(zhǔn)確吸取一定量的1.0 g/L混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液,分別用甲醇-水(3∶7, v/v)溶液稀釋成適當(dāng)濃度的50種抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取雄蜂蛹粉樣品(1.00±0.05) g,置于50 mL塑料離心管中,加入2 mL水,渦旋,加入10 mL 1%(體積分?jǐn)?shù))高氯酸溶液和5 mL 4% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))醋酸鉛溶液,渦旋混勻;以8 000 r/min離心3 min,上層清液轉(zhuǎn)移至50 mL塑料離心管中,再加入1 mol/L磷酸氫二鉀溶液調(diào)節(jié)溶液pH值至8,以8 000 r/min離心3 min,過濾,濾液轉(zhuǎn)移至50 mL試管中,在全自動固相萃取儀上凈化(方法見表1),收集洗脫液,置于10 mL試管中,于45 ℃用氮?dú)獯蹈蓛x吹干,加入1.0 mL甲醇-水(3∶7, v/v)溶液溶解殘?jiān)?過0.45 μm有機(jī)相和水相串聯(lián)濾膜,待液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

表 1 全自動固相萃取方法Table 1 Method of automatic solid phase extraction

1.4 分析條件

1.4.1氯霉素

色譜柱:Agilent Polaris C-18柱(100 mm×2.0 mm, 5 μm);流速:0.25 mL/min;流動相:A為水,B為甲醇。梯度洗脫程序:0～4.0 min, 30%B～90%B; 4.0～5.0 min, 90%B; 5.0～5.1 min, 90%B～30%B; 5.1～6.5 min, 30%B。進(jìn)樣量:25 μL。

離子源:電噴霧電離(ESI)源;掃描方式:負(fù)離子模式;毛細(xì)管溫度:350 ℃;噴射電壓:2.0 kV;鞘氣壓力:0.38 MPa;輔助氣流速:2 L/min。

1.4.2其他抗生素

色譜柱:Agilent Polaris C-18柱(100 mm×2.0 mm, 5 μm);流速:0.25 mL/min;流動相:A為0.1%(v/v)甲酸水溶液,B為甲醇。梯度洗脫程序:0～1.0 min, 10%B; 1.0～3.0 min, 10%B～30%B; 3.0～4.0 min, 30%B; 4.0～6.0 min, 30%B～95%B; 6.0～9.4 min, 95%B; 9.4～9.5 min, 95%B～10%B; 9.5～11.0 min, 10%B。進(jìn)樣量:25 μL。

離子源:ESI源;掃描方式:正離子模式;毛細(xì)管溫度:350 ℃;噴射電壓:2.5 kV;鞘氣壓力:0.38 MPa;輔助氣流速:3.3 L/min。

50種抗生素的保留時(shí)間、母離子、子離子和碰撞能量見表2。

表 2 50種抗生素的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 MS parameters of the 50 antibiotics

表 2 (續(xù))Table 2 (Continued)

* Quantitative ion.

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

根據(jù)歐盟2002/657/EC指令,質(zhì)譜確證方法必須達(dá)到4個(gè)確證點(diǎn)的要求,采用低分辨液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測時(shí),應(yīng)在確定母離子的基礎(chǔ)上選擇兩個(gè)以上的子離子。以分子離子為母離子進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描,最后采集全掃描的二級質(zhì)譜圖,得到碎片離子信息,然后再對得到的二級質(zhì)譜參數(shù),如碰撞能量進(jìn)行優(yōu)化,使定性離子與定量離子產(chǎn)生的離子對強(qiáng)度達(dá)到最大。根據(jù)此方法,得到50種抗生素的最佳質(zhì)譜參數(shù),結(jié)果見表2。

2.2 提取試劑的選擇

由于雄蜂蛹粉中蛋白質(zhì)含量較高,前處理過程中需盡可能地將蛋白質(zhì)去除,以便后續(xù)凈化。本實(shí)驗(yàn)首先選擇同時(shí)具有沉淀蛋白質(zhì)效果的高氯酸和三氯乙酸溶液作為提取試劑,比較了兩種溶液的提取效果,結(jié)果發(fā)現(xiàn)三氯乙酸溶液沉淀蛋白質(zhì)的效果較好,但檢測后發(fā)現(xiàn)雄蜂蛹粉中四環(huán)素類抗生素中的四環(huán)素、金霉素、土霉素和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素中的紅霉素、北里霉素、泰樂菌素?zé)o回收;采用高氯酸溶液提取,在前處理過程中發(fā)現(xiàn),提取離心后的濾液略有渾濁,凈化時(shí)易出現(xiàn)固相萃取小柱堵塞的情況;而提高酸的濃度會導(dǎo)致后期調(diào)節(jié)pH值時(shí)要加入更多的溶液。為使蛋白質(zhì)盡可能沉淀完全且不影響后續(xù)調(diào)節(jié)pH值的操作,選擇醋酸鉛以達(dá)到進(jìn)一步去除蛋白質(zhì)的目的,結(jié)果表明,采用高氯酸和醋酸鉛結(jié)合的方法,可以獲得較清澈的液體,而且不影響固相萃取的凈化效率。

比較了不同體積(5、10、15和20 mL)的1%(v/v)高氯酸溶液對雄蜂蛹粉沉淀蛋白質(zhì)的效果,結(jié)果發(fā)現(xiàn),采用10 mL的1%(v/v)高氯酸溶液時(shí)可以獲得相對清澈的溶液。

實(shí)驗(yàn)還比較了不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)(2%、4%、6%和8%)的醋酸鉛溶液沉淀雄蜂蛹粉中蛋白質(zhì)的效果,發(fā)現(xiàn)采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的醋酸鉛溶液就已經(jīng)可以達(dá)到沉淀蛋白質(zhì)的效果。同時(shí)比較了不同體積(5、10、15和20 mL)的4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))醋酸鉛溶液沉淀蛋白質(zhì)的效果,結(jié)果發(fā)現(xiàn),采用5 mL 4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))醋酸鉛溶液時(shí)沉淀效果最佳。

2.3 提取液pH值的優(yōu)化

大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類、磺胺類、四環(huán)素類、硝基咪唑類、林可霉素和氯霉素等50種抗生素的化學(xué)性質(zhì)相差較大,各化合物酸堿度不一。因此實(shí)驗(yàn)比較了不同pH值(pH 3～9)的提取液對各化合物提取效率的影響(見圖1)。由圖1可知,不同pH值提取液對氯霉素、四環(huán)素類抗生素和紅霉素影響最大,這可能與氯霉素和四環(huán)素類抗生素在強(qiáng)酸和強(qiáng)堿溶液中易分解、紅霉素在酸性條件下不穩(wěn)定的因素有關(guān)。綜合考慮,將提取液的pH值設(shè)為8。

圖 1 不同pH值提取液對目標(biāo)化合物提取效率的影響Fig. 1 Effect of different pH values of extraction solution on the extraction efficiencies of the target compounds

2.4 線性范圍與檢出限

對系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行測定,對目標(biāo)化合物的峰面積(Y)和對應(yīng)的質(zhì)量濃度(X, μg/L)進(jìn)行線性回歸,得到50種抗生素標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程、相關(guān)系數(shù)(r)、檢出限(LOD)和定量限(LOQ),結(jié)果見表3。50種抗生素在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)均>0.99。喹諾酮類抗生素的LOD為0.1 μg/kg, LOQ為5.0 μg/kg;林可霉素和大環(huán)內(nèi)酯類、磺胺類、硝基咪唑類抗生素的LOD為0.2 μg/kg, LOQ為10.0 μg/kg;四環(huán)素類抗生素的LOD為0.4 μg/kg, LOQ為20.0 μg/kg;氯霉素的LOD為0.008 μg/kg, LOQ為0.3 μg/kg。

表 3 50種抗生素的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 3 Linear equations, linear ranges, correlation coefficients (r), limits of detection (LODs) and limits of quantification (LOQs) of the 50 antibiotics

表 3 (續(xù))Table 3 (Continued)

Y: peak areas;X: mass concentration, μg/L.

2.5 回收率和精密度

本實(shí)驗(yàn)對50種目標(biāo)化合物進(jìn)行了3個(gè)添加水平的加標(biāo)回收試驗(yàn),每個(gè)水平做6個(gè)平行樣品,計(jì)算50種目標(biāo)化合物的加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差,結(jié)果見表4。

由表4可以看出,50種抗生素的平均加標(biāo)回收率為70.2%～118.3%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.8%～13.6%,滿足日常檢測的需求。

表 4 50種抗生素的平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 4 Average recoveries and relative standard deviations (RSDs) of the 50 antibiotics (n=6)

表 4 (續(xù))Table 4 (Continued)

Low, medium and high spiked levels: 5.0, 10.0 and 25.0 μg/kg for quinolones; 10.0, 20.0 and 50.0 μg/kg for lincomycin, macrolides, sulfonamides and nitroimidazoles; 20.0, 40.0 and 100.0 μg/kg for tetracyclines; 0.3, 0.6 and 1.5 μg/kg for chloramphenicol.

2.6 實(shí)際樣品檢測

在2017年度共檢測雄蜂蛹粉樣品50批次,其中5批次檢出土霉素,含量為21.0～40.0 μg/kg,陽性率為10%,說明雄蜂蛹粉中存在抗生素污染風(fēng)險(xiǎn),建立雄蜂蛹粉中多種抗生素殘留檢測的方法迫在眉睫。

3 結(jié)論

建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測雄蜂蛹粉中50種抗生素殘留的分析方法。該法簡便、快捷,可以實(shí)現(xiàn)雄蜂蛹粉中多種抗生素的快速測定,能夠滿足日常分析檢測的需要。