高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜檢測中國楊樹型蜂膠、巴西綠蜂膠和楊樹膠中的酚類化合物及真偽鑒別

陳 磊, 劉 蕓, 陳 雷, 張曉燕, 馮 峰, 張 峰

(1. 南京海關動植物與食品檢測中心, 江蘇 南京 210019;2. 中國檢驗檢疫科學研究院食品安全研究所, 北京 100176)

蜂膠是蜜蜂從植物芽孢和樹干處采集的樹脂混入蜜蜂上顎腺和蜂蠟等物質形成的一種具有芳香氣味的黏性膠狀固形物[1],其作為蜜蜂生存環境的天然屏障,可以有效維持整個蜂群的健康。一個5～6萬只的蜂群一年只能生產蜂膠70～110 g,蜂膠被譽為“紫色黃金”。由此可見,蜂膠的實際產量并不大,但目前我國市場上的蜂膠類產品卻種類繁多,其中不乏楊樹膠制成的偽品。因此,對蜂膠進行可靠的質量控制非常重要。我國目前實施的蜂膠國家標準(GB/T 24283-2009)中規定的感官指標包括結構、色澤、狀態、氣味和滋味,理化指標包括乙醇提取物含量、總黃酮和氧化時間。在實際檢測中發現,這些指標均不能有效區分蜂膠與楊樹膠,因為楊樹膠也可以達到檢測要求。目前用于產地為中國的蜂膠摻假鑒別的國標方法為GB/T 34782-2017。該方法利用高效液相色譜法檢測水楊苷和鄰苯二酚,對蜂膠和楊樹膠進行鑒別。此外,還有基于高效液相色譜指紋圖譜法的行業標準(GH/T 1087-2013)也能用于蜂膠摻假鑒別。但總的來說,蜂膠摻假的鑒別方法仍然偏少,不足以遏制目前的蜂膠摻假現象。

蜂膠的質量取決于其中所含有效活性物質的量。蜂膠中含有許多黃酮類、酚酸及其酯類、萜類和有機酸類物質[2-4]。其中,黃酮類與酚酸及其酯類同屬酚類化合物,是蜂膠療效的最主要來源[5]。已有大量文獻[6-9]報道,蜂膠中的這些生物活性物質顯示出廣譜抗菌、抗腫瘤、殺菌,局部麻醉、抗炎、降低血壓、受激免疫及抑制細胞、穩定細胞和促進細胞組織再生的生理活性。由于蜂膠含有的化學成分受植物來源影響比較大,所以在世界范圍內,不同地區蜂膠的化學成分也存在較大差異[10]。周夢瑤等[11]根據地域對世界主要蜂膠的植物來源及其化合物組成進行了綜述。張翠平等[12]根據植物來源將世界范圍內的蜂膠分為楊樹屬型、酒神菊屬型、克魯西屬型、血桐屬型和地中海東部地區型5大類。其中,楊樹屬型蜂膠(例如中國蜂膠)和酒神菊屬型蜂膠(俗稱巴西綠蜂膠)被研究和報道的比較廣泛和深入。

本文選取酚類化合物為研究對象,以高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜為研究手段,通過測定中國楊樹型蜂膠、巴西綠蜂膠、楊樹膠中的主要酚類化合物,進行定量檢測和差異性分析,篩選能用于辨別中國楊樹型蜂膠真偽、區別中國楊樹型蜂膠和巴西綠蜂膠的特征標志物,以改善現有的蜂膠質控方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260液相色譜儀串聯6530飛行時間質譜,配有自動脫氣機、二元高壓泵、自動進樣器、柱溫箱及Mass Hunter數據處理軟件(美國Agilent公司); PURELAB Option Q5超純水制備儀(英國ELGA公司); KH-500B型超聲儀(昆山禾創超聲儀器有限公司)。

中國楊樹型蜂膠、楊樹膠樣品采集自山東、湖北、河南、江蘇等地,巴西綠蜂膠為進出口企業送檢樣品。為保證樣品的含膠量一致,所選蜂膠及樹膠樣品均為乙醇提取物。

咖啡酸、白楊素、松屬素、刺芒柄花素、芹菜素、高良姜素、柚皮素、芫花素、咖啡酸苯乙酯、山柰酚、木犀草素、水楊苷、山柰素、阿替匹林C、槲皮素、異鼠李素、鼠李素、楊梅酮、桔皮素、蘆丁、香豆酸、肉桂酸以及阿魏酸標準品購自上海安譜化學試劑有限公司,純度均不小于99.5%;乙腈和甲醇(均為色譜純,德國Merck公司);實驗用水為超純水。

1.2 標準溶液配制

分別準確稱取10 mg咖啡酸、白楊素、松屬素、刺芒柄花素、芹菜素、高良姜素、柚皮素、芫花素、咖啡酸苯乙酯、山柰酚、木犀草素、水楊苷、山柰素、阿替匹林C、槲皮素、異鼠李素、鼠李素、楊梅酮、桔皮素、蘆丁、香豆酸、肉桂酸以及阿魏酸標準品,用甲醇定容至10 mL,得到1 g/L的標準儲備液。臨用前用甲醇逐級稀釋至適當濃度。

圖 1 23種酚類化合物(200 μg/L)的提取離子色譜圖Fig. 1 Extracted ion chromatograms of the 23 phenolic compounds (200 μg/L)

1.3 樣品前處理

稱取約0.2 g樣品,加入適量甲醇,超聲約15 min至完全溶解后,用甲醇定容至50 mL。取500 μL上述甲醇溶液至1.5 mL塑料離心管中,加超純水500 μL,渦旋混勻后以12 000 r/min的速度離心3 min,上清液過0.45 μm有機相濾膜后進樣。由于樣品中有些化合物含量非常高,用甲醇-水(1∶1, v/v)分別稀釋10、100和1 000倍后再次進樣。

1.4 色譜條件

色譜柱:Agilent Eclipse Plus C18(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm);柱溫:35 ℃;流速:200 μL/min;進樣量:10 μL;流動相:A相為乙腈,B相為0.1%(體積分數)甲酸。梯度洗脫程序:0～1.0 min, 30%A; 1.0～5.5 min, 30%A～55%A; 5.5～15.0 min, 55%A～70%A; 15.0～16.0 min, 70%A～30%A; 16.0～20.0 min, 30%A。

1.5 質譜條件

離子源:電噴霧離子(ESI)源;檢測模式:正離子;干燥氣流速:5 L/min;干燥氣溫度:325 ℃;霧化氣壓力:310 kPa;鞘氣溫度:400 ℃;鞘氣流速:12.0 L/min,離子掃描范圍:m/z100～1 000。

1.6 統計分析

使用SPSS 19.0軟件(美國SPSS公司)進行獨立樣本t檢驗(95%置信區間),分別比較中國楊樹型蜂膠與巴西綠蜂膠,中國楊樹型蜂膠與楊樹膠之間23種酚類化合物的含量差異,篩選特征化合物。

圖 1 (續)Fig. 1 (Continued)

2 結果與討論

2.1 線性范圍、檢出限與定量限

分別取適量23種化合物的標準儲備液,配制成10 mg/L的混合標準溶液,用甲醇-水(1∶1, v/v)逐級稀釋至200、100、50、20、10 μg/L。按照上述儀器條件檢測后,以化合物的峰面積Y對質量濃度X(μg/L)進行線性回歸,計算得到23種化合物的校正曲線方程。23種酚類化合物在10～200 μg/L范圍內線性關系良好,相關系數均大于0.99。桔皮素和刺芒柄花素的檢出限和定量限分別為0.2和1 μg/L,其他化合物的檢出限和定量限分別為2和10 μg/L。23種酚類化合物的提取離子色譜圖見圖1。

2.2 精密度和回收率

在10、25和50 mg/kg 3個添加水平下,分別考察23種酚類化合物在中國楊樹型蜂膠、巴西綠蜂膠和楊樹膠中的提取回收率。每個添加水平分別重復3次試驗,結果如表1所示,23種酚類化合物在3種

樣品基質中的提取回收率為70.2%～122.6%, RSD值均小于10%,滿足定量分析方法的要求。

2.3 實際樣品檢測

采用本文建立的檢測方法對10個中國楊樹型蜂膠、8個巴西蜂膠和10個楊樹膠中23種酚類化合物的含量進行測定,結果見表2。楊樹膠中阿魏酸、肉桂酸、白楊素、咖啡酸苯乙酯、松屬素、高良姜素的含量比較高。中國楊樹型蜂膠中咖啡酸、阿魏酸、白楊素、咖啡酸苯乙酯、松屬素、高良姜素含量比較高。巴西蜂膠中香豆酸、異鼠李素、山柰素、阿替匹林C含量比較高。3種樣品中均沒有檢測到蘆丁、楊梅酮、刺芒柄花素和桔皮素。

表 1 23種酚類化合物在中國楊樹型蜂膠、巴西綠蜂膠和楊樹膠中的回收率和精密度(n=3)Table 1 Recoveries and precisions of the 23 phenolic compounds in Chinese poplar propolis, Brazil green propolis, and poplar gum (n=3)

表 2 楊樹膠(n=10)、中國楊樹型蜂膠(n=10)和巴西綠蜂膠(n=8)中23種酚類化合物的含量Table 2 Contents of the 23 phenolic compounds in poplar gum (n=10), Chinese poplar propolis (n=10), and Brazil green propolis (n=8)

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中國楊樹型蜂膠和楊樹膠的主要植物來源都是楊樹,檢測結果顯示這兩組樣品中白楊素、松屬素、高良姜素含量都非常高,與文獻結論一致[10-12]。另外,這兩組樣品中阿魏酸和咖啡酸苯乙酯的含量也都很高。已有較多文獻[13-17]報道中國楊樹型蜂膠中這兩種化合物的含量較高。但是由于楊樹膠的相關研究較少,這兩種化合物在楊樹膠中的含量情況目前還存在疑問。如曹煒等[18]報道,楊樹芽提取物中阿魏酸和咖啡酸苯乙酯都有檢出,而Zhang等[19]報道楊樹膠中未檢出阿魏酸。

正是由于楊樹膠和中國楊樹型蜂膠的化合物組成存在諸多的相似性,所以楊樹膠經常用于中國楊樹型蜂膠的摻假。根據本文的檢測結果,兩者也有許多化合物的含量存在明顯的差異,可以用于中國楊樹型蜂膠摻假鑒別。例如水楊苷和肉桂酸,在楊樹膠中的含量遠高于中國楊樹型蜂膠(P<0.05),可以作為楊樹膠的特征化合物;反之,咖啡酸和香豆酸在中國楊樹型蜂膠中的含量遠高于楊樹膠(P<0.05),可以作為中國楊樹型蜂膠的特征化合物。在進行中國楊樹型蜂膠的摻假鑒別時,綜合考察楊樹膠和中國楊樹型蜂膠兩方面的特征化合物所得出的判定結論將會更加準確。其中,水楊苷、咖啡酸、香豆酸用于中國楊樹型蜂膠的摻假鑒別已有文獻[19,20]報道,肉桂酸在中國楊樹型蜂膠和楊樹膠中的含量差異尚未見文獻報道。

巴西蜂膠的主要植物來源為酒神菊樹,其化合物組成與中國楊樹型蜂膠存在較大的差異。檢測結果顯示,中國楊樹型蜂膠中咖啡酸、阿魏酸、白楊素、咖啡酸苯乙酯、松屬素、高良姜素的含量遠高于巴西蜂膠(P<0.05),可以作為中國楊樹型蜂膠的特征化 合物。而巴西蜂膠中香豆酸、異鼠李素、山柰素和阿替匹林C的含量遠高于中國楊樹型蜂膠(P<0.05),可以作為巴西蜂膠的特征化合物。其中,阿替匹林C作為巴西綠蜂膠的特有化合物已經有較多文獻[21,22]報道,而香豆酸、異鼠李素和山柰素在巴西綠蜂膠中的含量情況文獻報道較少[23]。

對于蜂膠中是否存在蘆丁,一直存在較大爭議。在早期的文獻和蜂膠標準[24-26]中,認為蜂膠中存在一定含量的蘆丁。但是近來有越來越多的文獻報道[18,19,27]蜂膠中并沒有檢測到蘆丁。因為蜜蜂在采集蜂膠時,唾液中含有的β-糖苷酶能水解連接在苷元上的糖配基[28]。因此,蜂膠中不含有蘆丁應該是比較可靠的結論。

3 結論

本文建立了一種同時檢測中國楊樹型蜂膠、巴西綠蜂膠和楊樹膠中23種酚類化合物的高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜方法,該方法簡單、準確、可靠。此外,通過檢測實際樣品中23種酚類化合物的含量并進行差異性分析,提出水楊苷、肉桂酸、咖啡酸和香豆酸可以作為中國楊樹型蜂膠摻假鑒別的特征化合物,而咖啡酸、阿魏酸、白楊素、咖啡酸苯乙酯、松屬素、高良姜素、香豆酸、異鼠李素、山柰素和阿替匹林C可以作為辨別中國楊樹型蜂膠和巴西蜂膠的特征化合物。