高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜對水產品中未知污染物的非定向快速篩查與測定

郭思言, 丁 濤, 殷 耀, 張曉燕, 柳 菡, 沈偉健,林 宏, 吳 斌, 鄧曉軍, 伊雄海, 楊功俊

(1. 南京海關動植物與食品檢測中心, 江蘇 南京 210019; 2. 中國藥科大學藥學院, 江蘇 南京 211198;3. 上海海關動植物與食品檢驗檢疫技術中心, 上海 200135)

我國是世界上最大的水產品生產國之一,國內市場供應豐富,國人對于水產品的需求也呈增長趨勢[1,2],水產品的安全性因此成為食品領域關注的焦點[3]。此前,原國家食品藥品監督管理總局在2017年兩次對全國經營環節重點水產品進行專項檢查和抽樣檢驗,檢出孔雀石綠、硝基呋喃代謝物、氯霉素和喹諾酮類等藥物殘留,不合格率達到9.5%～10.9%[4,5]。已有科學工作者就致病微生物、病毒、養殖與加工過程中漁藥的非法投入、甲醛及重金屬等不同危害來源進行了水產品領域的風險監測[6],但國內對水產品中其他品種環境污染物監測覆蓋率不高。污染物通常指農藥類、持久性有機污染物(persistent organic pollutants, POPs)和藥物及個人護理品(pharmaceutical and personal care products, PPCPs)等,主要由周圍環境帶入,因具有復雜和不確定性使水產品質量安全受到的威脅難以預測[7-9]。高分辨質譜因其掃描范圍寬,測定靈敏度高,結合相關數據庫可實現對未知化合物的定性被廣泛用于非定向篩查分析[10,11]。四極桿/靜電場軌道阱質譜作為高分辨質譜的一種,分辨率可達十萬,在無標準品及短時間內無法對分析物進行條件優化的情況下,通過準確測定分子離子峰的精確質量數、化合物同位素豐度比及二級碎片特征離子信息與基礎數據庫檢索匹配,實現大量數據的高通量分析,從而完成對樣品中藥物殘留的定性篩查[12]。因此,選擇高靈敏度、高準確性的高分辨質譜對水產品中含量較低的環境污染物進行非定向篩查分析較為合適。國外有相關研究證明水產品中已檢測到多溴聯苯、多氯聯苯及有機氯農藥在魚體內的聚集[13], Chiesa等[14]利用氣相色譜-串聯質譜法研究并測定了野生金槍魚中持久性污染物的含量,發現部分金槍魚中含有POPs,雖然沒有明確的毒性,但經過長時間生物積累,有可能會大量聚集在生物體中,對食品安全造成威脅。Nacher-Mestre等[15]利用氣相色譜-飛行時間質譜儀進行篩查發現毒死蜱、嘧啶磷在一些植物性飼料中檢出,而乙氧基喹啉在動物飼料和魚中檢出,但作者未對其含量進行測定。

本研究利用靜電場軌道阱高分辨質譜,通過采集樣品全息離子掃描-數據依賴二級離子掃描數據圖,結合含有1 729種環境污染物的數據庫對405個水產樣品中的環境污染物殘留進行高通量非定向篩查分析,樣品中除篩查出孔雀石綠、硝基呋喃代謝物、氯霉素和喹諾酮類等藥物殘留外,對未在我國水產品中要求相關限量的污染物三環唑、乙氧基喹啉和咖啡因進一步優化其樣品前處理條件,并進行定量。

1 實驗部分

1.1 標準品、試劑、材料和樣品

三環唑(tricyclazole)、乙氧基喹啉(ethoxyquin)、嗎菌靈(dodemorph)、氯吡脲(forchlorfenuron)、高滅磷(acephate)、二丙烯草胺(allidochlor)、噻嗪酮(buprofezin)、卡巴呋喃(cabofuran)、綠麥隆(chlortoluron)、二苯胺(diphenylamine)購自Sigma公司,純度≥95%;咖啡因(caffeine)、速滅威(metolcarb)購自Dr. Ehrenstorfer公司,純度≥95%。乙腈(色譜純)購自德國Merck公司;甲酸(色譜純)購自美國Tedia公司;無水硫酸鎂(分析純)購自南京化學試劑一廠;十八烷基硅烷粉(C18, 40～60目)和N-丙基乙二胺粉(primary secondary amine, PSA, 40～60目)購自美國Sepax-UCT公司;氯化鈉(分析純)購自南京化學試劑股份有限公司;石墨化炭黑(Carb-GCB)購自深圳逗點生物技術有限公司;Envi-Carb串聯PSA柱(500 mg/500 mg/6 mL)購自美國Supelco公司;水產樣品來自江蘇省水產批發和零售市場。

標準品用甲醇溶解配制成1 000 mg/L母液,4 ℃冰箱避光保存。根據實際需要稀釋成不同濃度的標準工作液。

1.2 儀器設備

Dionex 3000高壓液相色譜、Thermo Scientific Q Exactive高分辨質譜儀帶Trace Finder處理軟件(美國Thermo Fisher Scientific公司); ELGA-Q15高純水發生器(英國ELGA公司);渦旋混合器(北京來普特科學儀器有限公司)。

1.3 樣品前處理

1.3.1篩查分析通用前處理

稱取5 g(精確到0.01 g)水產樣品于50 mL具塞離心管中,加入10 mL乙腈,渦旋混勻3 min,超聲提取10 min,在8 000 r/min下離心3 min,取上清液于40 ℃水浴下氮氣吹干。加入1 mL甲醇-水(3∶7, v/v)渦旋30 s,過0.22 μm濾膜后供儀器分析。

1.3.2定量分析前處理

稱取2 g(精確到0.01 g)水產樣品于50 mL具塞離心管中,加入10 mL乙腈、4 g無水硫酸鎂、10 g氯化鈉置于渦旋混合器渦旋5 min,使樣品充分鹽析,超聲提取10 min, 8 000 r/min下離心3 min,轉移上清液至10 mL試管中,于40 ℃水浴中氮氣吹干。加入0.5 mL甲醇渦旋混勻,溶液轉移至1.5 mL離心管,加入水0.5 mL、PSA 50 mg、C1820 mg,以12 000 r/min離心3 min,過0.22 μm濾膜后供儀器分析。

1.4 儀器條件

1.4.1色譜條件

色譜柱:Phenomenex Kinetex C18色譜柱(100 mm×4.6 mm, 2.6 μm);流動相A為甲醇,流動相B為0.1%(v/v)甲酸水溶液;梯度洗脫程序:0～1.0 min, 10%A; 1.0～3.0 min, 10%A～40%A; 3.0～5.5 min, 40%A～95%A; 5.5～9.5 min, 95%A; 9.5～10.0 min, 95%A～10%A; 10.0～12.0 min, 10%A,流速:0.50 mL/min;柱溫:室溫;進樣體積:10 μL;分析時間:12 min。

1.4.2質譜條件

非定向篩查質譜條件 可加熱電噴霧離子(HESI)源,正負離子切換模式;檢測方式:全掃描數據依賴二級掃描(full MS-ddMS2);毛細管加熱溫度:320 ℃;鞘氣(N2)流速:40 L/min;輔助氣(N2)流速:10 L/min;吹掃氣(N2)流速:3 L/min;噴霧電壓:3 kV; Full MS掃描分辨率(R): 70 000;自動增益控制(AGC target): 3×106;最大駐留時間: 100 ms;掃描范圍:m/z100～1 500;閾值觸發值:1×105;頂點觸發時間: 2～8 s;動態排除時間:10 s; ddMS2掃描分辨率(R): 17 500;自動增益控制:1×105;最大駐留時間:50 ms; Top N: 5;分離窗口:m/z4.0;碰撞能量:40 eV;碰撞能量步進值:50%。

定量分析質譜條件 HESI源,正離子模式;檢測方式:目標離子二級掃描(target-MS2);毛細管加熱溫度:320 ℃;鞘氣(N2)流速:40 L/min;輔助氣(N2)流速:10 L/min;吹掃氣(N2)流速:3 L/min;噴霧電壓:3 kV;分辨率(R): 17 500;自動增益控制:2×105;最大駐留時間:100 ms。

1.4.3篩查方法

通過full MS-ddMS2模式和Trace Finder軟件對從實際樣品中采集到的數據進行篩查分析,檢索參數為:母離子精確質量數偏差為1×10-5,峰閾值強度為1×104,信噪比(S/N)為5,子離子精確質量偏差為1×10-5,匹配最少碎片個數為2,同位素豐度相似度為90%,同位素精確質量數偏差為1×10-5,在包含1 729種環境污染物的數據庫中檢索,篩查過程中全部符合以上設置條件的化合物為初篩通過。初篩通過的化合物采用Library Manager進行二級譜圖庫對比,二級離子質量數偏差為1×10-5,保留時間限定為±0.5 min,相似度大于0.7視為確證。

2 結果與討論

2.1 篩查方法的確立

為保證所建立的篩查方法在樣品通用前處理過程、整個質譜數據采集過程及篩查分析過程的精密度和準確性,本實驗選取8種具有極性和保留時間差異的農藥污染物(嗎菌靈、氯吡脲、高滅磷、二丙烯草胺、噻嗪酮、卡巴呋喃、綠麥隆、二苯胺)作為質控化合物對整個篩查過程進行監測。選擇空白水產樣品添加0.05 μg/g水平的上述8種混合標準溶液作為監測樣品,采用篩查過程所用前處理方法,按實驗中的色譜-質譜條件選擇含有1 729種污染物的數據庫進行匹配分析,對母離子精確質量數偏差、子離子精確質量數偏差、同位素豐度等條件進行優化,為保證上述8種化合物均能通過數據庫匹配,優化后設置的母離子及子離子精確質量數偏差1×10-5,同位素豐度相似度90%。進樣時將監測樣品一同分析,保證篩查過程的有效性。8種農藥污染物的提取離子流圖見圖1。

圖 1 8種農藥污染物的提取離子色譜圖Fig. 1 Extracted ion chromatograms of eight pesticide pollutants

本實驗通過對405個水產樣品應用1 729種環境污染物的數據庫進行初步篩查,結果表明樣品中存在我國未要求限量的風險化合物三環唑、乙氧基喹啉、咖啡因和速滅威。

2.2 定性分析

藥物非定向篩查基于高分辨數據庫,高分辨數據庫集儲存化合物多方位信息和化合物歸類一體化。實驗將待篩查項目中涉及的所有化合物信息導入數據庫,構成一個專屬性強的項目數據庫。數據庫所包含的信息:化合物名稱、結構式、分子式、精確質量數、美國化學文摘登記號(Chemical Abstracts Service)、離子化方式、分類、保留時間及碎片離子精確質量數信息等;此外,與高分辨數據庫結合進行化合物信息確證的Library Manager軟件有二級碎片離子譜圖儲存功能,可儲存化合物在一定碰撞能下的二級質譜圖,用于二級譜圖相似度檢索比對,為化合物定性確證提供更有利的匹配條件,減少假陽性。在篩查分析時根據需要進行條件設置,可提高篩查結果的準確性。但譜圖庫的數據量較大,過程建立復雜,需要的存儲空間較大。本實驗先進行基于高分辨數據庫的二級碎片篩查分析,對于篩查過程中發現的風險化合物三環唑、咖啡因、乙氧基喹啉和速滅威,將其與標準品的高分辨二級碎片譜圖數據庫進行二級離子碎片相似度較,通過優化精確質量數偏差、對比與標準品保留時間的差值進一步提高篩查結果的準確性,最終確定實際分析中二級離子質量數偏差為1×10-5,保留時間差限定為±0.5 min,相似度大于0.7。圖2為樣品中檢出化合物與標準品的二級譜圖碎片定性確認對比圖,樣品中篩查出的三環唑、咖啡因、乙氧基喹啉與實際標準品保留時間差小于0.5 min,并且譜圖相似度在0.75～0.95之間,定性通過,可進一步進行定量分析。由于速滅威標準品與實際水產樣品中篩查出的化合物保留時間差為3 min,譜圖相似度在0.44～0.54之間,故定性失敗,因此,最終確定樣品中含有三環唑、咖啡因和乙氧基喹啉。

圖 2 陽性樣品與標準品的二級碎片離子對比圖Fig. 2 Comparison of fragment ion mass spectra between positive samples and standards

2.3 定量分析條件的優化和方法學驗證

無凈化步驟的通用前處理過程可避免化合物的漏檢,但因存在基質效應干擾較大,檢測靈敏度低[16]。水產品中含有蛋白質和脂肪,基質成分較復雜[17],直接提取條件下8種作為質控的農藥回收率為40%～70%。需要優化前處理過程對陽性樣品中篩出的化合物進行準確定量。

相比于甲醇和乙酸乙酯,乙腈沉淀蛋白質的效果較好,對三環唑、咖啡因、乙氧基喹啉這3種化合物的提取效率較高,因此前處理采用乙腈提取。比較了固相萃取柱和QuEChERS方法對前處理過程的凈化效果。結果表明,Envi-Carb串聯PSA柱的凈化效果一般且費時,QuEChERS法處理快速且除脂效果較好。分別對除水劑和凈化劑的選擇進行優化,選取無水硫酸鎂作為除水劑時各化合物的回收率均較高,C18和PSA作為凈化劑可去除大部分脂質,石墨化炭黑加入后對部分含苯環化合物有一定的吸附作用,回收率偏低,其主要用于去除色素[18],而水產品中色素含量較少,因此選擇C18和PSA對樣品進行凈化。

質譜分析采用電噴霧正離子源,分別將質量濃度為1 000 μg/L的三環唑、乙氧基喹啉、咖啡因標準溶液進行一級質譜全掃描,選擇各化合物的分子離子優化碰撞能量并選擇干擾較少的子離子分別作為定性定量離子,見表1。配制質量濃度范圍為5～1 000 μg/L的混合標準溶液,以各物質的質量濃度(x, μg/L)為橫坐標,對應的峰面積(y)為縱坐標建立標準曲線,3種化合物在5～1000 μg/L范圍內線性關系良好,r2均大于0.99。3種化合物的檢出限(LOD)均為1 μg/kg,定量限(LOQ)均為5 μg/kg。分別在魚肉、蝦肉樣品中進行5、10、20 μg/kg 3個水平的加標回收試驗,3個添加水平下各化合物的平均回收率及精密度見表2。

表 1 3種化合物的質譜檢測參數Table 1 MS parameters of three compounds

*Quantitative ion.

表 2 3種環境污染物在魚、蝦樣品中的加標回收率和 精密度(n=6)Table 2 Recoveries and RSDs of the three environmental pollutants spiked in fish and shrimp samples (n=6)

2.4 定量分析與定性分析結果比較

將三環唑、咖啡因、乙氧基喹啉3種化合物在陽性樣品中的定量分析結果與定性結果進行比較發現:通過篩查方法定性確認的3種化合物在進行陽性樣品定量時也均分別檢出三環唑、咖啡因、乙氧基喹啉,且這3種化合物定量時采用的定性及定量離子均在篩查方法選用的子離子中,樣品與標準品的離子豐度比匹配度達80%以上。說明定性篩查方法準確,對于篩查通過的化合物可進行進一步的定量分析。

2.5 實際樣品的檢測結果及分析

利用建立的初篩方法對405個水產樣品進行高通量篩查定性分析,樣品包括鯽魚、鱖魚、黑魚、草魚、羅氏沼蝦、羅非魚、肉蟹、對蝦等品種,通過初步篩查確認樣品中存在三環唑、咖啡因、乙氧基喹啉3種污染物。采用優化后的條件對陽性樣品進行三環唑、咖啡因、乙氧基喹啉的定量分析,結果表明,樣品中三環唑的檢出率為1.2%,含量范圍在10.1～16.5 μg/kg;咖啡因檢出率為1.7%,含量范圍在5.2～5.8 μg/kg;乙氧基喹啉檢出率為1.2%,含量范圍在8.4～12.1 μg/kg。對結果進行分析,其中三環唑為農藥污染物,推測是由于不規范使用農藥帶來的水源或農作物污染,進而富集到水產品中[19];咖啡因是一種優勢污染物,在國內湖泊及地表水中均有檢出,其常在咖啡、茶、巧克力及可樂型飲料中用作興奮劑、苦味劑和香料;此外咖啡因也是一種重要的解熱鎮痛藥,復方阿司匹林的主要成分之一,在當今社會使用非常廣泛[20,21],因此水產品檢出咖啡因可能是由于水體污染造成的;乙氧基喹啉作為抗氧化劑常在飼料或漁用藥物中投入使用。目前GB 2763-2016中制定了三環唑在稻谷和蔬菜中的最大殘留限量為2 mg/kg,水果中乙氧基喹啉的最大殘留限量為3 mg/kg[20],水產品中均無相關要求。水產品中農藥限量僅滴滴涕和六六六兩項[22],與發達國家相比處于被動和落后的局面,引起關注度較低,建議今后加強重視程度,繼續開展深入的風險監測工作。

3 結論

本研究建立的高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜法結合Trace Finder篩查軟件對水產品中未知環境污染物進行高通量非定向篩查分析并確證,在此基礎上優化前處理條件對篩查化合物準確定量。篩查方法具有快速、高通量、高靈敏度特點,定量準確,可用于未知化學風險的監測分析,為有關風險評估部門監管污染物風險來源提供方向。