高效液相色譜-串聯質譜法測定蔬菜水果中雙甲脒及其代謝產物

黃 娟, 桂茜雯, 高 玲, 張曉燕, 沈偉健, 吳 斌, 丁 濤

(南京海關動植物與食品檢測中心, 江蘇 南京 210019)

雙甲脒(amitraz, AMZ)又稱N,N-雙(2,4-二甲苯亞氨基甲基)甲胺,是一種常見的有機氮殺蟲劑和殺螨劑,已廣泛用于果樹、蔬菜、茶葉、棉花等作物的害蟲防治[1]。單甲脒(semiamitraz, DMPF)是雙甲脒代謝的中間產物之一,也是良好的殺螨殺蟲劑,對螨的各個蟲期(卵、若蟲、成蟲)和抗性螨均有很好的防治效果,曾因其不穩定而無法商品化。但1987年科技工作者解決了關鍵技術,開始將單甲脒水劑工業化生產,并大面積推廣應用[2]。雙甲脒及其代謝產物均具有致癌性和可傳遞性,吸入、攝入或經皮膚吸收均會引起中毒,對肝臟損傷較大,會對人體及動物造成危害[3],其中單甲脒原藥的毒性大于雙甲脒[4]。

由于雙甲脒及其代謝產物的危害嚴重,各國紛紛制訂雙甲脒在食用農產品中的限量標準,以保證質量安全。其中,在GB 2763-2016標準中規定雙甲脒及其代謝產物在除棉籽油外的其他基質中最大殘留限量為0.5 mg/kg,在棉籽油中為0.05 mg/kg[5]。美國規定根據基質的不同雙甲脒的限量值在0.02～9 mg/kg之間[6]。日本規定在蔬菜水果中雙甲脒及其代謝產物的限量值在0.2～0.5 mg/kg之間[7]。

目前關于AMZ及其最終代謝產物2,4-二甲基苯胺(2,4-dimethylaniline, DMA)的研究報道較多,研究基質主要為動物源性食品,如蜂蜜、牛奶、水產品等,方法主要采用氣相色譜法[8]和氣相色譜-質譜法[9-11],高效液相色譜法[12]和液相色譜-質譜法[13]也偶有報道。

但實際上,在自然界中AMZ易首先代謝產生DMPF和2,4-二甲基苯基甲酰胺(2,4-dimethylformamidine, DMF)兩種中間產物,在沒有高溫、高濕或酸、堿的環境中,各種代謝產物都可以穩定、獨立存在,因此對每種化合物的殘留檢測都很重要。目前國內外基本集中研究AMZ和DMA[9,11,12],而對DMPF和DMF的研究較少。郭浩等[14]和侯建波等[15]分別針對水和蜂王漿的基質研究了同時檢測AMZ及其代謝產物等4種化合物的方法,但對于蔬菜水果這類種類較多且含水含色素較多的復雜基質尚無報道。液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)在抗基質干擾能力、準確性和靈敏度方面具有較強優勢,本文利用該技術建立了檢測蔬菜水果基質中AMZ、DMPF、DMF和DMA 4種化合物殘留量的方法。該法靈敏度高,定量限(LOQ)低于各國殘留限量要求,且穩定性和專屬性強。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

TSQ Quantiva三重四極桿質譜儀(配備ESI源,美國Thermo公司); Ultimate 3000高效液相色譜儀(美國Dionex公司); Buchi R-200旋轉蒸發儀(德國Buchi公司); WH-861渦旋混勻器(太倉市華利達實驗設備有限公司); SLGMA2-16K高速離心機(德國Sartorius公司); Z216MK臺式高速冷凍離心機(德國Hermle Labortechnic公司); SMART-N15VF超純水系統(上海力康超純水有限公司)。

AMZ、DMPF、DMF和DMA(純度≥98.5%)均購自德國Dr. Ehrenstorfer公司;正己烷、異丙醇、氫氧化鈉(分析純,南京化學試劑股份有限公司);甲醇和乙腈(色譜純,德國Merck公司);實驗用水均為超純水系統制備的二級水和三級水。

實驗用樣品均為送至本實驗室的待檢樣品。

1.2 標準溶液的配制

準確稱取10 mg標準品,置于10 mL容量瓶中,用乙腈稀釋定容,得到質量濃度為1.0 g/L的標準儲備液,于0～4 ℃冷藏儲存,備用。

取上述標準儲備液,用乙腈-水(50∶50, v/v)逐級稀釋,配制成質量濃度為1.0 mg/L的標準工作液,于0～4 ℃冷藏儲存,備用。

準確吸取適量標準工作液,用空白基質溶液稀釋成質量濃度為1.0、5.0、20.0、100.0和200.0 μg/L的標準工作曲線溶液,現用現配。

1.3 樣品前處理

準確稱取混合均勻的樣品5.0 g(精確至0.01 g),置于50 mL塑料離心管中,加入5 mL 0.1 mol/L NaOH溶液,渦旋混勻1 min,再加入15 mL正己烷-異丙醇(2∶1, v/v)提取液,渦旋混合1 min,以8 000 r/min離心5 min,吸取上層液轉移至50 mL玻璃離心管中,于35～40 ℃水浴中旋轉蒸發濃縮至近干,用0.5 mL乙腈溶解殘渣,轉移至1 mL離心管中;再用0.5 mL水溶解殘渣,轉移至同一離心管中,渦旋混勻，然后以12 000 r/min離心3 min,溶液過0.22 μm有機微孔濾膜,供儀器分析。

1.4 分析條件

色譜柱:Phenomenex Kinetex C18柱(100 mm×4.6 mm, 2.6 μm);柱溫:35 ℃;流動相:A相為0.1%(v/v)甲酸水溶液,B相為甲醇;流速:0.5 mL/min。梯度洗脫程序:0～2.0 min, 10%B; 2.0～3.0 min, 10%B～90%B; 3.0～8.0 min, 90%B; 8.0～9.5 min, 90%B～10%B, 9.5～10.5 min, 10%B。進樣量:25 μL。

離子源為電噴霧電離(ESI)源;掃描方式為正離子掃描;離子源溫度為350 ℃;離子傳輸管溫度為300 ℃;毛細管電壓為3 200 V;氣簾氣為氮氣,壓力為0.060 MPa;輔助氣為氮氣,流量為5.0 L/h;碰撞氣為氬氣,壓力為0.2 Pa(1.5 mTor);檢測方式為多反應監測(MRM)模式。雙甲脒及其代謝產物的母離子、子離子和碰撞能量見表1。

圖 1 雙甲脒的代謝路徑Fig. 1 Metabolism routes of AMZ

CompoundParent ion (m/z)Daughter ion (m/z)Collision energy/eVAMZ294.26163.11*15122.2529DMPF163.08122.18*17107.1825DMF150.18107.00*21132.0413DMA122.09107.16*18105.1618

* Quantitative ion.

2 結果與討論

2.1 提取溶劑的優化

AMZ在酸性環境下不穩定,環境pH值小于2時迅速降解成DMA,在pH值為3～6時,AMZ先水解成DMPF和DMF兩種中間體,然后再進一步降解成穩定的DMA(見圖1)。隨著pH值的提高,AMZ的水解速率明顯下降,穩定性增高,因此在提取溶劑中加入堿性溶液,可以防止AMZ在提取過程中的降解。

AMZ為胺類化合物,屬于兩性化合物,加酸形成鹽,加堿形成游離分子,結合酸性易降解的特性和相似相容原理,在堿性條件下分子形態的AMZ更易被有機試劑溶解提取。本文考察了對AMZ及其代謝產物溶解度較大的丙酮、甲醇、正己烷和正己烷-異丙醇(2∶1, v/v)4種有機試劑的提取效率(見圖2)。結果表明,丙酮和甲醇的提取效率較高,正己烷-異丙醇(2∶1, v/v)和正己烷的提取效率較低,但對于本文研究的蔬菜水果基質來說,丙酮由于吸附了較多的色素,使后期儀器分析中基質干擾變大;甲醇除了吸附色素外,還因其具有親水性,會導致提取液中含有部分水分,從而使雙甲脒發生水解。正己烷作為非極性物質,可以在提取過程中將水分和易溶于水的色素剔除,從而達到提取和凈化的目的。在提取液中加入少量異丙醇,可以讓AMZ及其代謝產物在提取溶劑中更加穩定,同時防止在后期的旋轉蒸發過程中暴沸。因此本文選擇正己烷-異丙醇(2∶1, v/v)作為提取溶劑。

圖 2 不同提取溶劑對4種目標化合物提取效率的影響Fig. 2 Effect of different extraction solvents on the extraction efficiencies of the four target compounds

2.2 定容溶劑的選擇

在儀器分析中,定容溶劑直接影響了分析物的峰形、分離度和靈敏度。色譜分析中,一般采用流動相定容,本文比較了0.1%(v/v)甲酸水溶液-甲醇(1∶9, v/v)溶液和乙腈-水(1∶1, v/v)溶液作為定容溶劑時的色譜分離效果。同時添加1 mL 1.0 mg/L的混合標準溶液至定容溶劑中,常溫放置一段時間,觀察放置時間對AMZ穩定性的影響。實驗發現,采用0.1%(v/v)甲酸水溶液-甲醇(1∶9, v/v)溶液定容后,AMZ在7 h時幾乎完全分解,而采用乙腈-水(1∶1, v/v)溶液定容后,AMZ可以保持24 h內穩定存在(見圖3)。因此選擇乙腈-水(1∶1, v/v)溶液作為定容溶劑。

圖 3 AMZ在不同定容溶劑中的降解圖Fig. 3 Degradation of the AMZ dissolved in the different solvents

圖 4 AMZ及其代謝產物(100 μg/L)的選擇離子 色譜圖和二級離子質譜圖Fig. 4 SIM chromatograms and MS2 spectra of AMZ and its metabolites (100 μg/L)

2.3 質譜條件的優化

2.3.1質譜參數

在正離子模式下對1.0 mg/L AMZ及其代謝產物的混合標準溶液進行全掃描,得到[M+H]-準分子離子峰,分別選擇該分子離子峰進行了二級質譜掃描。在MRM、正離子模式下,優化質譜參數,分別選擇信噪比高、峰形好、干擾小的子離子作為定量離子,選擇特異性強的子離子作為定性離子。圖4為AMZ及其代謝產物混合標準溶液(100 μg/L)的選擇離子色譜圖和二級離子質譜圖。

2.3.2基質效應

雙甲脒及其代謝產物在質譜上的離子抑制較強,因此,本文測定了目標化合物在空白基質標準溶液和溶劑標準溶液(100 μg/L)的峰面積,通過兩者峰面積差值的絕對值與溶劑標準溶液峰面積的比值,計算離子抑制率,來評價基質效應。結果表明,AMZ、DMPF、DMF和DMA的離子抑制率分別為23.9%、35.9%、7.9%和19.6%,說明基質對AMZ、DMPF和DMA的離子抑制相對較強。因此本文采用空白基質添加標準溶液的方式配制標準工作曲線溶液來減弱基質效應。

2.4 方法學驗證

2.4.1線性范圍與定量限

取適量標準工作液用空白基質溶液分別配制成質量濃度為1.0、5.0、20.0、100.0和200.0 μg/L的標準工作曲線溶液,按本方法確定的條件分別進樣分析,以目標化合物的峰面積對其質量濃度繪制標準曲線。結果表明,4種目標化合物在線性范圍內呈良好的線性關系,線性相關系數(r)均大于0.99(見表2)。以信噪比(S/N)>10確定4種目標化合物的定量限,結果為0.01～0.4 μg/kg。

表 2 4種目標化合物的回歸方程、相關系數和定量限Table 2 Regression equations, correlation coefficients (r) and limits of quantification (LOQs) of the four target compounds

Y: peak area;X: mass concentration, μg/L.

2.4.2回收率和精密度

對青菜和柑橘兩種代表性基質進行0.5、5.0、20.0 μg/kg 3個水平的添加回收試驗,每個水平重復6次,測定兩種基質中AMZ及其代謝產物的平均回收率和相對標準偏差(見表3)。結果表明,方法的平均回收率為62.5%～105.0%,相對標準偏差為7.5%～17.6%。

2.5 實際樣品測定

應用本方法對近期送至本實驗室的32批蔬菜包括黃瓜、青(紅)椒、茄子、玉米粒、針菇和番茄等各種基質的樣品進行測定,發現共檢出4批陽性樣品,番茄樣品檢出AMZ,含量為1.5 μg/kg;黃瓜和白金針菇檢出DMA,含量分別為2.1 μg/kg和3.5 μg/kg;紅椒檢出DMPF,含量為0.2 μg/kg。

表 3 青菜和柑橘中AMZ及其代謝產物在3個加標水平下的加標回收率及相對標準偏差(n=6)Table 3 Recoveries and relative standard deviations (RSDs) of the AMZ and its metabolites at three spiked levels in green vegetable and orange samples (n=6)

3 結論

建立了液相色譜-串聯質譜檢測蔬菜水果中雙甲脒及其代謝產物的方法。該法采用串聯質譜的檢測方式，能有效排除復雜基質對目標化合物的干擾,并滿足對目標化合物的定性定量檢測要求。