氙氣預(yù)處理對(duì)心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌細(xì)胞保護(hù)作用研究

朱 婧，郭建麗

1.陜西省人民醫(yī)院麻醉科(西安710068);2.內(nèi)蒙古鄂爾多斯市中心醫(yī)院麻醉科(鄂爾多斯 017000)

急性心肌梗死是嚴(yán)重威脅人類健康及導(dǎo)致人類死亡的心血管疾病。介入、溶栓及搭橋術(shù)是目前臨床常用的治療急性心肌梗死的手段，可及時(shí)恢復(fù)病變區(qū)血流再灌注，挽救瀕死心肌細(xì)胞；然而缺血區(qū)血流再灌注有時(shí)會(huì)加速心肌死亡，擴(kuò)大梗死區(qū)面積，引發(fā)心肌缺血再灌注損傷(Myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)。以往諸多研究顯示，MIRI不僅局限于局部組織，且會(huì)對(duì)遠(yuǎn)隔器官組織造成影響，從而影響患者預(yù)后轉(zhuǎn)歸[1-3]。因此，如何預(yù)防MIRI及其對(duì)遠(yuǎn)隔器官組織的影響成為目前國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)。報(bào)道顯示，可通過(guò)抑制心肌缺血再灌注損傷機(jī)體心肌細(xì)胞凋亡及機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)等途徑，保護(hù)心肌細(xì)胞。近年來(lái)，多項(xiàng)研究顯示，麻醉藥物、尤其是吸入性麻醉藥物預(yù)處理MIRI具有很好的保護(hù)作用。氙氣是麻醉效果良好的理想型吸入惰性氣體。大量研究證實(shí)，氙氣預(yù)處理具有很好神經(jīng)及心臟保護(hù)作用[4-5]。因此研究擬通過(guò)觀察氙氣預(yù)處理對(duì)MIRI大鼠心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響，探討氙氣對(duì)MIRI大鼠心肌細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)材料 己糖激酶(K-H)液、0.5倍肺泡最小有效濃度(Minimum alveolar concentration，MAC)氙氣飽和K-H液，即40%氙氣+35%氮?dú)?25%混合氣體飽和K-H液、1 MAC即75% 氙氣+25%氧氣混合氣。成年雄性SD大鼠64只，體重265～350 g，由第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。采用隨機(jī)抽簽方式將其均分為四組，每組16只：假手術(shù)組(S組)、MIRI組(模型組)、0.5 MAC疝氣預(yù)處理+心肌I/R組(0.5 XR組)和1 MAC疝氣預(yù)處理+心肌I/R組(1 XR組)。

2 動(dòng)物處理

2.1 MIRI模型制備：SD大鼠采用腹腔注射劑量為50 mg/kg的戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，待麻醉成功后將其固定于手術(shù)臺(tái)上，剪毛消毒后切開(kāi)大鼠右頸，分離總動(dòng)脈備用；切開(kāi)暴露氣管組織，內(nèi)置氣管套管，隨后連接動(dòng)物呼吸機(jī)進(jìn)行正壓通氣通氣(呼吸頻率約60～70次/min)，于其四肢皮下接通電極，與BL-420S型生物機(jī)能系統(tǒng)進(jìn)行連接以持續(xù)記錄大鼠心電圖。在大鼠胸骨左緣部位做縱向切口，并在第5肋間開(kāi)胸，打開(kāi)大鼠心包，充分暴露心臟；之后采用6-0號(hào)無(wú)損傷縫合線在左耳下緣2 mm處穿過(guò)左冠狀動(dòng)脈前降支，使心肌缺血30 min，松開(kāi)結(jié)扎線后再灌注120 min。MIRI模型制備成功的標(biāo)注為：缺血時(shí)局部心肌組織呈蒼白、發(fā)紺狀，心電圖監(jiān)測(cè)顯示ST段明顯抬高或出現(xiàn)T波高聳；缺血區(qū)在出現(xiàn)血流再灌注后心肌組織轉(zhuǎn)紅，心電圖監(jiān)測(cè)中所出現(xiàn)的明顯抬高的ST段下降50%以上。

2.2 實(shí)驗(yàn)處理：S組大鼠開(kāi)胸后至穿線不進(jìn)行左冠狀動(dòng)脈前降支的結(jié)扎，持續(xù)150 min；模型組則在結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支使心臟缺血30 min后，松開(kāi)結(jié)扎線使血流再灌注120 min；0.5 XR組采用0.5 MAC氙氣預(yù)處理60 min，分4個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)用含有0.5 MAC氙氣的K-H液灌注5 min，然后再用純K-H液進(jìn)行10 min的洗脫，4個(gè)循環(huán)結(jié)束后進(jìn)行左冠狀動(dòng)脈前降支的結(jié)扎缺血處理30 min，復(fù)灌注120 min；1 XR組則使用1 MAC氙氣的K-H液進(jìn)行預(yù)處理，預(yù)處理過(guò)程同0.5 XR組。

3 觀察指標(biāo)

3.1 心肌梗死面積評(píng)估：再灌注結(jié)束，每組取4只大鼠阻斷左冠狀動(dòng)脈前降支，通過(guò)頸內(nèi)靜脈注射伊文斯藍(lán)，心肌正常區(qū)發(fā)生藍(lán)染，快速取出心臟并分離出左心室，并將心室橫斷成2 mm厚的組織塊；同時(shí)分離出正常的藍(lán)染組織。將未發(fā)生染色的危險(xiǎn)區(qū)組織置于0.5%TPT中，并于37℃條件下水浴處理15 min，10%福爾馬林進(jìn)行24 h固定。梗死區(qū)則發(fā)生染色呈現(xiàn)灰白色，于顯微鏡下對(duì)其進(jìn)行切割稱重。心肌梗死范圍=梗死區(qū)心肌質(zhì)量/危險(xiǎn)區(qū)心肌質(zhì)量×100%

3.2 心肌細(xì)胞凋亡：再灌注結(jié)束，每組取4只大鼠處死，快速切除心臟并分離出左心室。使用細(xì)胞凋亡測(cè)定試劑盒測(cè)定心室內(nèi)凋亡心肌細(xì)胞數(shù)量，細(xì)胞核為藍(lán)色的屬于正常細(xì)胞，棕黃色為凋亡陽(yáng)性細(xì)胞。標(biāo)本切片于400倍鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)為凋亡細(xì)胞總數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比。

3.3 血清生化指標(biāo)：再灌注120 min后取4只大鼠，經(jīng)腹部取其主動(dòng)脈血樣5 ml， 3000 r/min條件下，4℃冷凍離心15 min，獲得血清-20℃保存用于測(cè)定血清肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、一氧化氮合酶(eNOS)活性。CK、CK-MB、eNOS測(cè)定均選擇免疫熒光法，其中CK、CK-MB試劑盒基蛋生物科技股份有限公司，eNOS試劑盒購(gòu)自于南京信帆生物技術(shù)有限公司。

3.4 氧化應(yīng)激指標(biāo)：再灌注結(jié)束，每組4枚心臟中取其左室固定部位心肌組織0.5 cm×0.5 cm×1 cm，做勻漿處理，取10%的勻漿液置于4℃低溫離心機(jī)中進(jìn)行離心，2000 r/min條件下離心8 min。采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定心肌組織中超氧化物歧化酶(SOD)活性，選擇硫代巴比妥酸法測(cè)定丙二醛(MDA)含量，谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)采用雙抗體夾心法測(cè)定。所用試劑盒均購(gòu)自于上海紀(jì)寧實(shí)業(yè)有限公司。

結(jié) 果

1 四組大鼠再灌注120 min后心肌梗死范圍和細(xì)胞凋亡指數(shù)對(duì)比 見(jiàn)表1。與S組相比，模型組心肌梗死范圍明顯增大，心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著升高(P<0.01)；與模型組比，0.5 XR組和1 XR組大鼠心肌梗死范圍顯著縮小，心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著下降(P<0.05)。但0.5 XR組和1 XR組大鼠心肌梗死范圍和心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 四組大鼠再灌注120min后心肌 梗死范圍和細(xì)胞凋亡指數(shù)對(duì)比(%)

注：與對(duì)照組比， *P<0.01；與模型組比，#P<0.05

2 四組大鼠心肌組織中SOD、MDA、GSH-PX含量對(duì)比 見(jiàn)表2。與S組相比，模型組大鼠心肌組織中SOD、GSH-PX含量顯著減少，MDA含量顯著增加(P<0.01)；與模型組比，0.5 XR組和1 XR組大鼠SOD、GSH-PX含量顯著增加，MDA含量顯著下降(P<0.05)。但0.5 XR組和1 XR組大鼠心肌組織中SOD、MDA、GSH-PX含量間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 四組大鼠心肌組織中 SOD、MDA、GSH-PX含量比較

注：與對(duì)照組比，*P<0.01；與模型組比，#P<0.05

3 四組大鼠再灌注120 min后血清CK、CK-MB、eNOS活性對(duì)比 見(jiàn)表3。與S組相比，模型組大鼠血清CK、CK-MB活性顯著增強(qiáng)，eNOS活性顯著下降(P<0.01)；與模型組比，0.5 XR組和1 XR組大鼠CK、CK-MB活性顯著降低，eNOS活性顯著增強(qiáng)(P<0.05)。但0.5 XR組和1 XR組大鼠血清CK、CK-MB、eNOS活性間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 四組大鼠再灌注120min后血清 CK、CK-MB、eNOS活性對(duì)比

注：與對(duì)照組比， *P<0.01；與模型組比，#P<0.05

討 論

MIRI是一個(gè)涉及細(xì)胞凋亡、氧化自由基產(chǎn)生、諸多炎癥介質(zhì)和免疫因子釋放等過(guò)程的復(fù)雜性病理反應(yīng)。缺血再灌注后抗氧化物質(zhì)大量消耗，氧自由基等毒性產(chǎn)物大量積累，破壞心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)，激活機(jī)體炎癥反應(yīng)，造成心肌進(jìn)一步損傷，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡加速，梗死范圍擴(kuò)大。預(yù)先對(duì)臟器做短暫的缺血再灌注處理后，通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥介質(zhì)釋放，激活神經(jīng)傳導(dǎo)通路等，可提高器官組織的抗MIRI能力，此方法即為缺血預(yù)處理。目前，缺血預(yù)處理被認(rèn)為是臨床中有效的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制。許多實(shí)驗(yàn)證實(shí)，揮發(fā)性麻醉藥物預(yù)處理具有一定器官組織保護(hù)作用。

氙氣臨床特性接近理想型吸入麻醉藥物，其血?dú)夥峙湎禂?shù)較低，因此對(duì)心血管系統(tǒng)的抑制作用相對(duì)較小。賈平等研究顯示，不同時(shí)相氙氣預(yù)處理均可降低腎臟缺血再灌注損傷[6]。眾所周知，miRNA參與多種器官IRI的發(fā)展和缺血預(yù)處理的保護(hù)作用。Jia通過(guò)miR-21體內(nèi)敲除和miR-21靶通路分析來(lái)確定氙氣預(yù)處理對(duì)于腎臟IRI的保護(hù)作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)氙氣預(yù)處理2 h可對(duì)腎臟IRI提供形態(tài)學(xué)和功能性保護(hù)作用[7]；Li等研究表明，75%氙氣預(yù)處理可可通過(guò)阻斷IRI引起的線粒體結(jié)構(gòu)改變，開(kāi)放mitoKATP通道，從而顯著改善兔模型心功能，縮小其心肌梗死面積，減少細(xì)胞凋亡，抑制CK-MB釋放[8]；Liu等發(fā)現(xiàn)，氙氣處理通過(guò)激活A(yù)KT和ERK信號(hào)通路，減輕大鼠脊髓IRI程度[9]。IRI會(huì)導(dǎo)致心肌組織細(xì)胞中SOD、GSH-PX等自由基清除酶含量下降，導(dǎo)致機(jī)體氧自由基大量堆積；進(jìn)一步脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)導(dǎo)致機(jī)體MDA含量增加；eNOS為調(diào)節(jié)NO合成的限速酶，NO具有擴(kuò)張血管、抑制炎癥細(xì)胞功能，改善冠脈血液供應(yīng)的內(nèi)源性信號(hào)分子，具有很好的保護(hù)心肌內(nèi)皮細(xì)胞的功效[10]。同時(shí)，心肌缺血還會(huì)對(duì)細(xì)胞膜造成損傷，使得通透性增加，從而導(dǎo)致CK、CK-MB釋放至血液，因此血清中CK、CK-MB含量也是反應(yīng)心肌細(xì)胞損傷程度的良好指標(biāo)。本研究選擇阻斷左冠狀動(dòng)脈前降支的方式造成大鼠缺血30 min，之后恢復(fù)灌注120min獲得MIRI模型。研究結(jié)果顯示，與S組比，模型組心肌梗死范圍顯著增加，心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯升高，心肌組織中SOD、GSH-PX和血清e(cuò)NOS活性顯著下降，MDA含量顯著增加，血清CK、CK-MB活性顯著增強(qiáng)，提示MIRI模型制備成功。筆者在預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，參照文獻(xiàn)選擇0.5 MAC氙氣和1MAC氙氣進(jìn)行預(yù)處理。結(jié)果提示氙氣可通過(guò)抑制大鼠MIRI后氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制心肌組織進(jìn)一步損傷。但0.5 XR組和1 XR組大鼠各指標(biāo)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上所述，氙氣預(yù)處理可通過(guò)抑制大鼠機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少心肌細(xì)胞凋亡數(shù)目及心肌梗死面積，降低CK及CK-MB釋放，從而達(dá)到保護(hù)心肌細(xì)胞的預(yù)處理功效。但加大氙氣使用百分比后對(duì)心肌細(xì)胞保護(hù)作用有限。