指紋圖譜技術在葡萄及葡萄酒研究上的應用

張晶瑩，魏彥鋒*，梁紅敏，崔玲玲

（山東省葡萄研究院，山東濟南 250100）

葡萄是葡萄科（Vitaceae）葡萄屬（VitisL.）落葉藤本植物，在世界范圍內廣泛種植，品種豐富，具有極高的經濟價值。截止到2016年，我國葡萄栽培面積達84.7萬 hm2，產量1374.5萬 t[1-2]，入圃保存的葡萄種質資源超過3000份[3]。葡萄種質資源豐富，易芽變，易扦插繁殖，且不同地區之間品種交流頻繁，造成同名異物或同物異名現象嚴重，給葡萄的選育和推廣帶來很多不便。葡萄酒作為葡萄最主要的加工產品，其質量與原料種植的生態環境、品種、采收釀造年份等有著密切的關系，隨著葡萄酒市場的擴大，一些低劣、假冒葡萄酒產品給消費者帶來很多困擾和損害。目前，鑒定和評價葡萄及葡萄酒品質的方法主要是通過測定主要化學成分，或理化指標、感官審評等，具有一定的局限性，缺乏客觀的科學量化依據。

指紋圖譜技術，是在現代分析技術的基礎上，發展起來的從整體上研究復雜物質體系的一大類技術的統稱。以圖譜的形式呈現，強調對植物研究對象“共有特征性”的研究，并在共有特性中尋找個性差異。目前在中藥或天然藥物質量控制領域應用最為成熟，是國際公認的最有效手段。指紋圖譜技術首先將樣品經適當前處理，再采用一定的分析手段，得到能夠標示其某一特征的圖譜，最后將譜學分析法與計量學處理方法相結合，建立葡萄指紋圖譜能有效解決葡萄品種鑒定、產地識別、種屬相關等問題，建立葡萄酒指紋圖譜能準確區分和鑒別釀造品種、酒齡和產地。筆者就近年來指紋圖譜技術在葡萄及葡萄酒方面的應用研究進行綜述。

1 指紋圖譜技術的分類

隨著指紋圖譜的應用范圍不斷擴大及新技術的產生，其分類也在不斷延伸、細化。目前，根據不同的分析手段和特征性成分，可將指紋圖譜分為生物指紋圖譜和化學指紋圖譜兩大類：生物指紋圖譜包括蛋白質指紋圖譜、DNA指紋圖譜等；化學指紋圖譜包括光譜指紋圖譜、色譜指紋圖譜等。

1.1 生物指紋圖譜

生物指紋圖譜是由多態性豐富的電泳圖譜組成的，具有高度的特異性和穩定性，能夠鑒別生物個體或群體之間的差異。根據電泳分離的物質不同，可分為蛋白質指紋圖譜和DNA指紋圖譜，后者在葡萄種質資源研究領域應用較多。蛋白質指紋圖譜，或叫蛋白電泳指紋圖譜，主要是以聚丙烯酰胺凝膠電泳技術（SDS-PAGE）來完成的，在國內外廣泛用于水稻、玉米、小麥、大麥、豌豆等作物的品種鑒定與分類中，在煙草種子、川白芷種子、貝母等植物相關研究中也有探索。葡萄蛋白質主要集中在葡萄籽中，而葡萄籽約占葡萄重量的5%左右[4]，經過脫脂脫酚工序后的葡萄籽粕中的粗蛋白含量僅為11%～13%[5]，蛋白質含量低且不易提取純化是蛋白質指紋圖譜技術在葡萄研究領域應用較少的原因，所以本文不再討論。

DNA指紋圖譜是目前最具吸引力的生物鑒定技術。生物體內存在一些高變異性的DNA序列，它們能在本類群或個體中穩定遺傳，從而在生物體內表現出穩定的、可遺傳的差異。DNA指紋圖譜技術就是利用這些DNA序列，通過不同的分子標記技術來構建的。首先利用共同的引物，對多個對象進行檢測，然后尋找出檢測對象中變異性相對較大的特定DNA片段，最后擴增，以電泳圖譜的形式展現，即作為該檢測對象的特征性DNA指紋圖譜。常用的分子標記技術有：簡單重復序列或微衛星標記（SSR）、內部簡單重復序列（ISSR）、擴增片段長度多態性（AFLP）、單核苷酸多態性（SNPs）、隨機擴增多態性DNA（RAPD）、單核苷酸多態性（SNP）、相關序列擴增多態性（SRAP）等[6]。

1.2 化學指紋圖譜

化學指紋圖譜是建立在化學成分系統研究的基礎上，運用色譜、光譜等現代分析技術，以圖形、圖像和數據的方式對物質的特性和有效成分進行表征，并加以描述，從而全面反映植物對象所含化學成分的種類與數量，進而達到識別真偽、辨認優劣和質量判定等目的。

光譜技術主要有紫外光譜、紅外光譜、熒光光譜、核磁共振光譜等，目前廣泛應用于中藥、食品、香精香料等行業的質量控制和品質鑒定中。光譜技術應用在葡萄酒主要成分的定性分析較多，定量分析也大都只針對某一指標如酒精度、pH、糖類、酸類等。李霞[7]用近紅外光譜結合PLS法，以95個‘赤霞珠’干紅葡萄酒樣品為研究對象，建立了5個品質指標定量模型，創新了組合預處理方法。但研究發現，近紅外光譜技術不適用單體花色苷成分的檢測，而花色苷是紅葡萄酒中最重要的特性成分，所以光譜指紋圖譜不適于在葡萄酒領域應用推廣，所以本文不再單獨討論，有以色譜技術為主光譜技術為輔的指紋圖譜方法在下文中出現。

色譜指紋圖譜技術在葡萄酒研究領域應用較多，應用的色譜技術以高效液相色譜（HPLC）、氣相色譜（GC）為主，還有儀器聯用技術如氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）、液相色譜-質譜聯用（HPLC-MS）等。

2 DNA指紋圖譜技術在葡萄研究上的應用

葡萄栽培主要是利用其無性繁殖的特性，易于品種傳播和品質保持。但由于葡萄屬種間雜交容易，使得一個品種可能有來自多個類群的血統，即會產生一些中間型或過渡型雜交；加上自然雜交、栽培環境不同以及自身變異等，這些因素都導致了葡萄品種混淆、不易分辨的普遍現象。

傳統的種質鑒定方法以形態學為主，如對表型性狀“嫩梢梢尖形態”“幼葉表面顏色”“上表面光澤”等的描述，這種方法易受環境條件和主觀因素的影響。而且隨著育種工作中骨干親本的集中使用，葡萄品種間的遺傳差異越來越小，因此僅憑對表型性狀的差異描述很難做到準確鑒定和分類。基于DNA分子標記技術的指紋圖譜方法可以大大提高種質鑒定的準確度，減少工作量，它具有多態性高、數量豐富、遺傳穩定、多為共顯性、遍及整個基因組等優點，為保護葡萄種質資源和全面系統命名提供了有效的技術支持。近幾年，許多學者嘗試利用RAPD、SSR、SRAP、ISSR、AFLP等分子標記技術從DNA水平上對葡萄屬植物進行品種間的遺傳多樣性、親緣關系和品種鑒定等方面的研究。

2.1 親緣關系分析

葡萄植株樣本親緣關系越近，分子標記的多態性差異越小，反之亦然。DNA指紋圖譜技術就是利用了這一性質，有效識別品種的親本和后代，進而重新構建品種的親緣關系系譜，為遺傳改良提供依據。姚玉新等[8]為明確釀酒葡萄品種‘蛇龍珠’的身份，先用RAPD將14個釀酒品種劃分為4個類群，再用SSR對‘蛇龍珠’所在類群進一步分析，證實了‘蛇龍珠’是一個獨立的品種，和‘品麗珠’‘美樂’‘赤霞珠’有較近的親緣關系。Laucou等[9]利用20對SSR引物對葡萄砧木品種‘弗卡（Fercal）’進行分析，確定其母本為‘B.C. n°1B’、父本為‘31 Richter’，排除了傳統記載中錯誤的父本來源‘333 Ecolede Montpellier’，為‘弗卡’的系譜重建提供了理論依據。史圓圓等[10]采用SRAP分子標記技術結合聚類分析，對23個國內外主流的無核葡萄品種的種質親緣關系進行分析，結果顯示23個品種被分為4個類群，其中歐亞品種間親緣關系較近，歐美雜種具有較高的遺傳多樣性，雜交育種時應注意親本選擇。郭春苗等[11]對新疆44個相對適宜制干葡萄品種（系）進行了基于SSR標記遺傳多樣性分析，按照親緣關系的遠近聚為五大類，并利用4條引物構建了品種DNA指紋圖譜，提示同一引物在不同品種間出現相同譜帶的現象不可避免，試驗中視情況增加引物組合數量、結合形態學數據完善圖譜是十分必要的。尹玲等[12]收集了國內新育成的24個鮮食葡萄品種，采用6對國際通用的SSR熒光標記引物進行擴增，通過毛細管電泳進行基因分型，證明了SSR標記可用于品種鑒定、區分種屬以及判定倍性，最終建立了外加10個對照組總共34個品種的指紋圖譜，可用于品種間親緣關系的鑒定。

2.2 品種鑒定

通過分子標記繪制的指紋圖譜具有個體特異性，不受環境、發育階段的影響，能準確、快速而省時地鑒定品種或品系，為作物育種和種質管理提供了極大的便利。張永輝等[13]對來源于國家果樹種質鄭州葡萄資源圃的16個中國野生種葡萄及65個近緣植物的供試材料進行分類研究，ISSR聚類結果顯示‘毛葡萄1099’真實身份應屬于桑葉葡萄，懷疑‘燕山葡萄0947’是一個種間雜種，混進了美洲葡萄的血緣。金炳奎等[14]以東北長白山區的葡萄品種為材料，對SRAP分子標記技術體系進行優化，結果表明每個品種都能找出其特有條帶，6個山葡萄品種最少可用2對引物來鑒別。Daniela[15]利用RAPD標記對來自兩個種植區的10個鮮食葡萄品種的遺傳多樣性和親緣關系進行分析，并構建了系統分析樹；鮑露等[16]針對葡萄葉片富含多糖和多酚類等雜質影響DNA的提取純化問題，對AFLP流程進行優化改進并建立體系，成功區分了‘超藤’和‘藤稔’這兩個親緣關系十分接近的品種。溫景輝等[17]利用SSR標記技術將20份葡萄材料分為4大類群，進一步將山葡萄與歐亞種、美洲雜種很好的分開。楊航宇等[18]利用SSR標記技術對43份葡萄品種構建DNA指紋圖譜，并與VIVC標準數據庫進行比對，可將釀酒品種和鮮食品種、歐亞種和歐美雜種很好的區分。

2.3 分子身份證及數據庫管理系統的建立

近幾年，植物“分子身份證”的相關研究十分火熱，2014年北京市農林科學院玉米研究中心，通過20多年的努力，為18 000多個玉米品種建立了分子身份證，建成世界最大的玉米DNA指紋庫，囊括了我國全部玉米品種，還有大量國外玉米品種及組合。“分子身份證”是在DNA指紋圖譜基礎上提出的概念，即每個種質都擁有一個屬于自己的字符串形式的代碼，賦予種質本身作為識別品種的一個標準。杜晶晶等[19]以保存在國家葡萄品種資源圃內的80份葡萄種質為試材，利用SSR標記技術，證明了該法可有效用于建立葡萄種質資源分子身份證。Emanuelli等[20]利用SSR和SNP標記技術，并結合基因型和表型信息的對比，對歐洲葡萄種質進行遺傳多樣性和種群結構評價，深入分析了歐洲種質內部的遺傳特性。王慧玲等[21]以北京市農林科學院13個葡萄新品種為試材，利用SSR標記技術建立指紋圖譜，并賦值編碼構建分子身份證，為新品種保護提供一定的參考。董志剛等[22]利用SSR標記技術對15份釀酒葡萄進行親緣關系分析，以及種質識別和分類，通過多態性譜帶有序編碼轉換，構建其分子身份證系統，也證明了方法的可行性。

由此可以看出，葡萄“分子身份證”的構建才剛剛起步，構建的過程也促使DNA指紋圖譜技術的應用更加規范、準確和深入。比如可利用盡量少且是國際通用的引物來區分大量的品種、降低數據的冗余程度等。在所得到的圖譜后加上涵蓋品種詳細信息，即將“分子身份證”與形態學描述相結合，就可建立更加完善的葡萄品種分子數據庫。李貝貝等[23]對314個葡萄品種進行了DNA指紋數據庫的初步構建，并將其中61份中國葡萄品種的基因型數據，與歐洲葡萄品種分子數據庫（www.vivc.de）中的數據進行了對比，但該數據庫是以Excel表格形式呈現出來的，不利于共享。所以要建立更加完善的葡萄品種數據庫，還需對數據分析、圖譜識別、系統整合等方向做深入研究。

3 色譜指紋圖譜技術在葡萄酒研究上的應用

一款高品質葡萄酒幾乎都會冠上“產地酒”“品種酒”和“年份酒”的標簽，彰顯著較高的商業價值，但其真實性很難快速查證。目前，我國現行的葡萄酒質量標準只對理化指標、衛生指標有嚴格的要求。在國際上，除了理化及衛生指標外，也只加重了感官鑒定的比重。所以對于葡萄酒的釀造品種、產地甚至年份的考察幾乎沒有科學準確的方法，這也讓不法廠家有了各種形式的造假可能。

應用色譜指紋圖譜技術可以全面且直觀地反映葡萄酒中的化學成分種類與數量，利用酒中特征性成分，對葡萄酒的真實屬性及品質進行有效評價。指紋圖譜技術不需要測定葡萄酒的各種化學成分，即不需要對單一成分進行定量，避免使用昂貴的標準樣品，只需對酒中特征性化學成分的含量或組成利用色譜分析方法展現出來，從宏觀上分析被測酒樣之間的差異，為葡萄酒質量控制提供科學有效的方法。常用的色譜方法有高效液相色譜（HPLC）、氣相色譜（GC），還有些儀器聯用方法如氣相-質譜聯用（GC-MS）、高效液相色譜-質譜聯用（HPLC-MS）等。

HPLC主要是以葡萄酒中不易揮發的特征性組分如多酚類物質為檢測對象再結合模式識別方法來建立圖譜。樣品前處理簡單，不需要定性每個成分，只需要確保一致性，能滿足以指紋圖譜方法來控制葡萄酒質量、辨別真偽的主要目的，所以HPLC具有相當的優勢[24]。GC則適用于具有揮發性成分的葡萄酒香氣的指紋圖譜研究，它具有樣品用量少、選擇性強、分離速度快且效能高等優點。揮發性成分也是鑒定葡萄酒品種的重要依據，不同品種釀造的葡萄酒，香氣組分會有顯著差異，甚至存在特有的典型香氣。儀器聯用方法如GC-MS、HPLC-MS不僅利用了色譜的高分離效能，還兼備了質譜鑒定的準確性和高靈敏性，能夠提供指紋圖譜中主要成分的化學結構信息，還能克服因色譜峰重疊而造成的定性、定量不準確的問題，已成為化學指紋圖譜技術研究的重要手段。

3.1 葡萄酒品種的鑒定

釀造品種是決定葡萄酒質量的根本因素，但采用DNA鑒定方法沒有意義，因為從葡萄酒中提取DNA幾乎是不可能的。葡萄酒釀造品種由于其遺傳特性，在化學成分上表現出較大的差異，例如不同葡萄品種的多酚物質含量構成會有一定的差異，所以多酚物質的含量和比例能直接反應紅葡萄酒品種[25]。國內外對葡萄及葡萄酒中的花色苷（花色素）、單體酚等多酚類物質進行了大量的研究和鑒定，但從整體性上對葡萄酒多酚指紋圖譜的研究、對不同品種葡萄酒進行識別的相關研究才剛剛起步。

Revilla等[26]利用HPLC分析發現，‘赤霞珠’‘美樂’‘門西亞（Mencía）’‘加爾納恰（Carnacha）’葡萄品種的花色苷圖譜存在明顯的不同，‘加爾納恰’葡萄酒的錦葵色素葡萄糖苷相對含量達到64.69%，顯著高于其他品種葡萄酒，‘赤霞珠’的錦葵色素乙酰葡萄糖苷相對含量達到30.35%，顯著高于其他品種。張軍翔等[27]利用HPLC建立了9個不同品種葡萄酒的花色苷指紋圖譜，數據顯示出各品種葡萄酒之間花色苷種類和含量存在差別，山葡萄種及雜種葡萄酒的特征色譜峰中，有一些明顯與歐亞種不同，由此可作為判別標準。郭艷波[28]以2～3個年份的南方野生山葡萄酒為研究對象，葡萄來源分別為福建省溪塔溝產刺葡萄品種和廣西引種的‘桂葡一號’毛葡萄，構建了南方野生葡萄酒中單體酚HPLC指紋圖譜，很好的區分了兩個品種的山葡萄酒。

3.2 酒齡和產地的區分

酒齡是紅葡萄酒重要的商業指標之一，消費者普遍認為酒齡越大其葡萄酒的質量越好、價格越貴。近些年，各式各樣的葡萄酒品鑒培訓活動廣受歡迎，雖然感官品嘗可以鑒定葡萄酒酒齡，但需要高超的品鑒技藝和豐富的品酒經驗，主觀影響因素很大。因此，急需客觀科學的葡萄酒酒齡鑒定方法，為質量監督部門和消費者提供方法依據。

較年輕的紅葡萄酒中存在大量的游離花青素，使葡萄酒體呈紫紅色，隨著陳釀時間的延長，尤其是陳釀1年后，游離花青素迅速減少[29]，聚合形成更加穩定的色素形態如單寧，酒體會由亮紫色轉向磚紅色，而老齡葡萄酒苦澀味減輕、磚紅色褪去。所以利用葡萄酒陳釀過程中花青素和聚合色素的變化規律，采用HPLC指紋圖譜方法，可分析鑒定紅葡萄酒酒齡。張軍翔等[30]研究發現，6個不同酒齡的‘蛇龍珠’葡萄酒的HPLC花青素指紋圖譜明顯不同。李彪[31]結合GC-MS和IR技術對不同品牌、但同酒精度同香型的白酒進行研究，所建指紋圖譜可以區分不同年份的白酒，該研究中建立的方法和識別用的模型可以為鑒定葡萄酒的酒齡提供參考。

國內外葡萄酒長期生產實踐及研究表明，酒體中的酚類物質、香氣物質的含量和比例與生產地域密切相關，也就是說，來自不同地域的同一品種葡萄酒，其特性明顯不同[32]。王秀芹等[33]發現5個不同產地的‘赤霞珠’葡萄酒中，酚酸、黃烷-3-醇和黃酮醇這3種酚類物質的含量存在明顯差異。韓國民[34]在確定了葡萄酒中14種單體酚的HPLC測定方法的基礎上，分別建立了來自四川九寨溝和云南香格里拉的‘赤霞珠’干紅葡萄酒的HPLC指紋圖譜。謝建軍等[35]研究南非、法國、澳大利亞、智利等10個常見葡萄酒產地的85份紅葡萄酒樣品GC指紋圖譜，結果表明不同國家的紅葡萄酒GC指紋圖譜存在差異，其色譜峰的相對峰面積和數量不同，即各有特征峰，證明該法可以用來甄別假冒產地葡萄酒。張憲臣[36]等通過使用GC-MS建立了進口‘霞多麗’干白葡萄酒香氣物質特征指紋圖譜，使用HPLC-DAD-MS建立了進口‘霞多麗’干白葡萄酒酚類化合物特征指紋圖譜，進而建立了利用雙指紋圖譜溯源產地的方法。

3.3 真偽葡萄酒鑒定

目前國內市場上一般存在3種情況的摻假葡萄酒：第一，摻水。目的是降低葡萄酒的生產成本；第二，添加商標上未說明的化學物質，如色素。目的是增強葡萄酒顏色，提高外觀品質；第三，進行商標上未說明的勾兌，如使用非歐洲種勾兌歐洲種葡萄酒。目的是降低生產成本，提高感官品質。劣質葡萄酒輕者是假冒品種、酒齡和產地，夸大產品價值；重者直接通過各種造假手段進行偽造。而現行的葡萄酒質量標準中，只是對酒中常量或微量理化成分、微生物和重金屬含量進行了限定，如何利用化學或物理方法對葡萄酒的品質進行更加準確的評定是當前學術領域研究的熱點。

莫寅斌[37]通過試驗研究建立了葡萄酒HPLC花色素指紋圖譜及識別模式，對賀蘭山東麓的不同品種紅葡萄酒進行了區分，還對市售葡萄酒進行鑒別，成功鑒定出一款摻水和另一款添加了黑米色素的摻假葡萄酒。謝建軍等[38]通過對10個主要葡萄酒生產國所產的85份紅葡萄酒進行GC分析，提取紅葡萄酒12個典型的共有峰，構建了紅葡萄酒GC標準指紋圖譜，能夠對市場上常見的3種所謂“三精一水”勾兌的假葡萄酒成功鑒別。

4 總結與展望

在葡萄種質資源研究領域，應用基于DNA分子標記技術的指紋圖譜技術，可以從DNA水平上對葡萄屬植物進行品種間的遺傳多樣性、親緣關系和品種鑒定等方面的研究，進而建立葡萄分子身份證及數據庫管理系統。要建立一個完善的數據庫系統，需要整合信息資料（品種信息、引物信息等）、數據類資料（DNA指紋數據、形態學性狀數據等）和圖片類資料（形態性狀的圖片、擴增產物的電泳圖等），這也是研究者們繼續深入的目標，為中國葡萄栽培育種及種質資源的保護利用提供理論依據和技術支持。

另外，將葡萄DNA指紋圖譜技術與QTL（數量性狀基因座）定位相結合，可為研究葡萄重要性狀的基因定位、克隆產生巨大促進作用。劉震東[6]采用SSR和SRAP兩種分子標記技術分別構建了‘紅地球’‘雙優’‘北冰紅’的分子遺傳圖譜，對其雜交后代、自交后代的抗寒性進行鑒定及QTL定位研究，為抗寒基因的定位、克隆，以及分子標記輔助育種創造了可能性，對提高葡萄抗寒育種水平具有重要意義。

在葡萄酒研究領域，應用色譜指紋圖譜技術，根本目的是研究和控制葡萄酒的質量。其意義在于：葡萄酒指紋圖譜可以通過保留時間來定性分析酒中某類化學成分的數量與組成，若使用標準品還可以精確定量，為監控葡萄酒質量提供有力的保障。規范葡萄栽培實踐，提高葡萄酒生產廠家對產品質量的控制標準。葡萄酒指紋圖譜標準的制定，必須建立在對葡萄酒來源的全面了解基礎上，即確保酒品質及來源信息的真實準確性。

還有幾個問題值得注意：以花色苷為被檢測對象進行分析建立指紋圖譜的方法，僅適用于紅葡萄酒，因為紅葡萄酒在皮、汁混合發酵過程中，將大量花色苷留在了酒體中，而白葡萄酒經皮汁分離僅用果汁發酵，花色苷含量很少，不適用此法。紅葡萄酒中花色苷種類、含量和比例，主要受葡萄品種影響，所以在建立酒齡和產地的指紋圖譜分析中，首先要避免葡萄品種差異的影響。除了葡萄品種，還有一些外在因素對酒中多酚類物質有影響，比如陳釀條件不同，特別是較高的溫度會減少游離花青素含量，造成酒齡指紋圖譜的改變，影響鑒定的準確性，所以葡萄酒HPLC指紋圖譜鑒定酒齡的方法目前僅適用于同一生產廠家的葡萄酒，特別是在商標上標明年份的紅葡萄酒酒齡的區別鑒定，即適合葡萄酒生產企業用來制定企業標準，利于品質控制。