SNP技術在葡萄研究中的應用進展

張正文，王詠梅，任鳳山，趙艷俠，王鵬飛，邵學東*

（1. 君頂酒莊有限公司，山東蓬萊 265607；2. 山東省葡萄研究院/山東省葡萄栽培與精深加工工程研究中心/農業部華東都市農業重點實驗室，山東濟南 250100）

SNP指的是在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性，全稱為Single Nucleotide Polymorphism，是目前被發現的第三代遺傳標志。單核苷酸變異的原因包括轉換、顛換、缺失和插入，其數量很多，多態性豐富。一般而言，SNP是指變異頻率大于1%的單核苷酸變異[1]。SNP技術是目前最新一代的分子標記技術，應用于分子標記的優點是分布廣、多態信息量大、易于檢測和統計[2]。SNP分子標記在葡萄研究中的應用前景包括：（1）作為分子標記應用于鑒定品種；（2）在雜交育種中作為分子標記確定雜交后代；（3）作為分子標記應用于遺傳圖譜的構建及QTL的鑒定；（4）作為分子標記應用于全基因組關聯分析（Genome-wide association study，GWAS）分析；（5）應用于葡萄分子設計育種。在所有SNP的檢測方法中，對DNA片段進行直接擴增、測序是最為準確的方法。目前常用的SNP檢測方法包括全基因組測序法、全基因組SNP芯片、SNPlex系統檢測法等。

1 前、后基因組時代過渡階段SNP在葡萄研究中的應用

早在2004年，就有研究者開始研究葡萄中的SNP。Chevreux等人開發了一個EST（expressed sequence tags，表達序列標簽）序列組裝器，該程序可以基于EST序列檢測和分類不同變異的SNP[3]。當時葡萄及大部分植物基因組測序尚未完成，所以葡萄SNP的研究只能基于EST庫等數據。2007年，Troggio等[4]利用釀酒葡萄‘西拉’和‘黑比諾’作為父母本構建雜交群體，繪制了基于483個SNP的葡萄遺傳連鎖圖譜。當時葡萄基因組尚未公布，下一代測序技術還較為落后，當時他們利用PCR擴增EST片段技術進行SNP分析。2008年，Vezzulli等[5]利用3個釀酒葡萄的雜交組合構建了一個綜合參考遺傳圖譜，該圖譜的構建應用了501個SNP。該研究鑒定SNP的方法已經更新為EST文庫測序和細菌人工染色體測序（BAC-end sequences），技術上比PCR擴增測序有了較大進步[5]。那時葡萄基因組數據剛剛被公布[6]，但還沒有被廣泛應用。因此也未能被應用到該研究中。同年，Lijavetzky等[7]很快利用葡萄基因組數據開發了葡萄基因組重測序法（re-sequencing approach）和SNPlex系統分析技術用于高通量分析葡萄SNP。他們在葡萄中使用了SNPlex基因分型技術，并在2008年將研究葡萄SNP多態性的研究成果公布[8]。同年，Pindo[9]緊隨其后利用SNPlex系統鑒定了563個葡萄的新SNP。此后葡萄SNP技術的發展主要圍繞葡萄基因組數據，下一代測序技術及高通量芯片領域。2009年，由于下一代測序技術的進步，簡化基因組文庫（Reduced representation libraries，RRLs）技術出現。同年，Myles等[10]利用該技術從17個葡萄品種（10個栽培品種和7個野生種）中鑒定了幾十萬個SNP，并開發了9K genotyping芯片技術，為葡萄品種、種間鑒定和SNP分型提供了足夠的分辨率。了解種間的關系是進化生物學的一個基本目標，通過下一代測序和相關技術鑒定的SNP使葡萄種間系統發育分析成為可能。2013年，Miller等[11]提出了利用SNP技術發展葡萄系統基因組學，并認為利用SNP技術分析葡萄種間進化關系比表型觀察更為準確。2015年，De Lorenzis等[12]開發了vitis18SNP芯片，用來分析71個格魯吉亞特有栽培及野生葡萄種質，并鑒定出18775個SNP。

隨后2015—2016年的幾項研究，標志著SNP技術應用重心從鑒定葡萄品種的研究轉為QTL、功能基因及表型相關SNP的研究。2015年，Chen等[13]利用下一代限制位點相關DNA測序（restriction site associated DNA-seq，RAD-seq）技術，在復雜親本的釀酒葡萄雜交種[(V.vinifera×V.amurensis)×(V.labrusca×V.riparia)×V.vinifera]中共發現1826個SNP?；诖藰嫿烁呙芏冗z傳圖譜，并首次定位了控制葡萄中單糖（果糖、葡萄糖）和酸（蘋果酸和酒石酸）的QTL。2015年，Houel等[14]用18K SNP芯片對129株來自于‘Picovine×白玉霓’Flb的雜交群體進行基因分型，并在親本圖譜上鑒定出10個穩定的關于葡萄果實發育和品質或葉面積的QTL。2016年，Zyprian等[15]基于151個葡萄個體的SNP分析，定位出一個位于18號染色體的抗霜霉病的主效QTL，和一個位于15號染色體的抗白粉病的主效QTL。2015年，Tello等[16]鑒定出葡萄果實數目和果穗第一分枝長度相關的SNP。2015年，Pereira等[17]對22不同葡萄品種中花色苷合成途徑中的chalcone isomerase（CHI）和UDP-glucose:fl avonoid 3-O-glucosyltransferase（UFGT）基因進行SNP分型鑒定。結果顯示，CHI基因在序列中呈現5個單核苷酸多態性，在UFGT基因中共發現58個SNP，從而可利用這些SNP區分22個品種中的18個不同基因型[17]。雖然很多SNP與葡萄表型的關聯分析被研究，但當時還沒人開始嘗試葡萄GWAS研究。2016年，Catalano等[18]將SNP技術應用于葡萄酒鑒定，開發了一種基于SNP的葡萄酒可追溯性方法。

2 近3年SNP技術在葡萄研究中快速發展

2017—2019年，SNP技術應用于葡萄研究的目的和手段雖無革命性改變，但研究總量有了大幅提升。這與下一代測序、芯片技術的高速發展相關。這期間，我們搜索到至少15篇相關的高水平SCI論文。GWAS這種基于SNP技術的研究方法在葡萄中開始被應用。2019年，Guo等[19]利用GWAS分析，鑒定出了葡萄果實重量、味道、紋理等表型相關的QTL。同年，Liang等[20]利用GWAS分析，鑒定出了葡萄果實性狀、芳香化合物等表型相關的SNP和基因。2018年，Lauco等[21]利用18k SNP genotyping array芯片探測了783個葡萄品種中的10207個SNP，并利用GWAS技術分析了與葡萄基本表型相關聯的SNP。2018年，Sapkota等[22]利用GWAS技術定位出‘諾頓’（Norton）葡萄抗霜霉病相關的QTL。

此外，2018年，Smith等[23]鑒定了根結線蟲和黃褐變線蟲抗性關聯的SNP。2018年，Ma等[24]利用重測序鑒定SNP的方法研究東亞野生葡萄種的系統發育關系及遷徙路線。結果表明，東亞葡萄最可能的遷徙路線是從東北亞向南，到南亞和東南亞。其他相關研究還包括：利用SNP基因分型闡明麥格納（Magna Graecia）葡萄種質遺傳多樣性及其傳播的歷史淵源[25]，用于鑒定葡萄品種的SNP探測平臺發展[26]；利用高通量測序鑒定SNP，解釋葡萄進化關系，北美種和歐亞種葡萄之間的關系[27]；利用SNP技術研究圓葉葡萄和歐洲葡萄的雜交滲入情況[28]；利用SNP技術研究意大利撒丁島葡萄品種的序列多態性和結構變異[29]，野生和栽培葡萄SNP的探測等[30]；利用SNP技術研究格魯吉亞葡萄品種的親緣關系[31]；葡萄的馴化、糖度、香氣的人工選擇研究等[32]。

2018年日本一項新規則規定，以產自日本的葡萄原料釀造的葡萄酒應標為“日本葡萄酒”。日本釀酒葡萄品種‘甲州’（Kosyu）是通過SNP技術認定的日本本地品種。其釀造的葡萄酒帶有柑橘香味?！砝倜倒濉∕uscat Bailey）也是日本培育的本地品種，它特有的芳香已確認是呋喃妥所致。這些特點也已經被找到相關的SNP，用來鑒定日本葡萄酒[33]。

3 感想和展望

SNP技術在葡萄研究中突飛猛進的發展，對于葡萄育種、新品種鑒定、功能基因等領域的研究意義重大，推動了葡萄基礎研究領域的發展，進而能推動葡萄和葡萄酒產業的快速進步。后基因組時代，SNP技術得到了廣泛的應用，并大放異彩。

目前葡萄研究中還存在很多的問題，可以利用SNP技術解決。例如，我們如何更好的確定雜交后代？作者認為利用全基因組測序技術檢測子代中含有父母本SNP的比例是一個較為科學的方法[21]，這比簡單的用幾個分子標記去檢測更為可信。隨著SNP技術的完善，進一步推動檢測成本降低，也許該技術將來會成為一個檢測雜交后代的金標準。目前，SNP在分子設計育種中的應用報道較少，相信將來會增多。預測SNP技術對分子設計育種也將起到重要作用。