輔助生殖技術與印記基因疾病的研究進展

艾初初 施曉鋆（通訊作者）

（貴州醫科大學 貴州 貴陽 550004）

自從1978年，世界第一例試管嬰兒Louise Brown的誕生以來，輔助生殖技術逐漸成為不孕不育夫婦助孕的重要方式。ART主要包括的操作有體外受精、胞漿內單精子注射（ICSI）及植入前遺傳學診斷等[2]。盡管通過這種方式使得數千萬的家庭孕育了自己的孩子，但由于ART涉及到誘導排卵、配子操作等非自然受孕過程，導致配子及胚胎的醫源性應激，可能會對子代產生一定的影響，其安全問題越來越引起廣泛的重視。有研究顯示，輔助生殖技術在一定程度上導致早產、胎兒宮內發育異常以及印記基因相關疾病的發生[3-5]。1993年以來，通過建立動物模型，發現胚胎培養會明顯影響胎兒發育以及印記基因的表達[6]。大量動物模型試驗和人類流行病學研究表明ART操作可能會在配子形成和早期胚胎發育時期影響印記基因調控[7]。對輔助生殖技術出生的兒童的隨訪研究表明，ART并沒有增加先天性畸形的發生率，然而，它增加了表觀遺傳疾病的發生率，如BWS、AS、SRS等。ART可能與在配子發生期間或受精后立即發生表觀遺傳重新編程的基因組印記異常風險增加有關[8]。

1.印記基因

生殖遺傳是指通過兩性生殖細胞內染色體上的基因，將遺傳信息代代傳遞下去，使得子代具有親代的表型特征，遵循孟德爾遺傳定律[9]。而由沃丁頓于1942年首次提出的表觀遺傳學則主要研究的是在不改變DNA核苷酸序列的前提下基因表達發生改變的機制，具有不遵循孟德爾遺傳定律、獲得遺傳改變表觀遺傳的特點[10]。基因組印記是對基因組進行表觀遺傳修飾的表觀遺傳過程，即在不改變DNA序列的情況下，沉默一個親本等位基因，只表達單等位基因[11]。其中，父系等位基因不表達者就稱為父系印記，而母系等位基因不表達者則稱為母系印記。目前發現的父系印記基因主要包括：H19、IGF2R、TSSC3、MASH2、GRAB10等，母系印記基因則主要包括：IGF2、PLAGL1、MEST、PEG等[12]。印記基因在胎兒的生長發育中有重要的作用，來自小鼠模型和罕見的人類印記障礙的證據表明，父系表達的基因有促進胎兒生長的作用，而母系表達的基因則抑制胎兒生長。有研究發現，胰島素樣生長因子軸和IGF2/H19位點胰島素/IGF生長因子軸包括胰島素（INS）、IGF1、IGF2及其相應受體（IR、IGF1R、IGF2R）和6個結合蛋白（IGFBP16），是影響出生前后生長的關鍵調節的內分泌因子。IGF2R位于人類染色體6q25.3，主要功能之一是溶酶體靶向和降解IGF2，從而起到抑制生長的作用。IGF2和H19位于人類11p15染色體上，它們的相互印跡是由印跡控制區1（ICR1）的差異甲基化控制的，通常只在父系等位基因上甲基化。未甲基化的母體ICR1可與CTCF轉錄因子結合，阻斷IGF2啟動子對H19下游增強子的通路，從而激活H19表達。相反，CTCF蛋白被阻止與父系甲基化的ICR1結合，導致IGF2啟動子與增強子相互作用，導致單等位基因的父系IGF2表達。大約50%的生長受限SRS病例在ICR1處甲基化缺失，這可能導致SRS的生長受限[13]。在哺乳動物的發育過程中，基因組信息有兩次大規模的重新編碼階段，主要是表觀遺傳修飾的改變。第一個時期主要在原始生殖細胞的發育過程中，DNA去甲基化消除表觀遺傳修飾，然后在配子的成熟過程中再重新甲基化，加上印記標識；第二個時期則主要發生在早期胚胎植入階段，雖然這個時期DNA進行大規模的去甲基化改變，但是印記基因甲基化水平并不改變[7]。甲基化水平變化最強烈的階段在配子形成和早期胚胎發育時期。如果在此期間發生不完全去甲基化或者過早發生再甲基化，可能會導致胚胎的死亡或者在子代出生后發生各種遺傳病[14]。ART操作可能會在配子形成和早期胚胎發育時期影響印記基因調控，印記基因igf2/H19異常甲基化可能會引起一些生長障礙，例如BWS、RSS、宮內和產后生長遲緩綜合征等，通過ART技術出生的孩子患BWS綜合征的比例相對較高[15]。Soejima等也提出BWS與印記基因igf2/H19有關[16]。對配子及早期胚胎的研究結果顯示：ART操作不僅會引起低甲基化，而且會引起高甲基化，不僅會引起父源等位印記的異常而且會引起母源等位印記的異常[17]。ART目前還不能在精卵受精之前鑒別精子和卵細胞中染色體的表達是否完全正常，也不能確定原來正常的精子與卵細胞在受精時是否會出現異常。精子和卵細胞結合受精的過程是表觀遺傳修飾重置的關鍵階段之一，若在受精過程發生變異也可能會傳給子代[7]。有研究顯示，男性不育患者中精子的基因甲基化發生了改變，并且可能傳遞給子代[18]。而ICSI技術可能會增加印記疾病發生率，不成熟的精子可能尚未建立適當的印記或甲基化因而被注入受精后影響胚胎發育[19]。有報道一位男性不育患者經ICSI技術出生的女嬰患RSS，其甲基化研究顯示父源性igf2/H19印記基因區域呈低甲基化中狀態。進一步證明，ART可能與父源性等位基因突變有關[20]。

2.輔助生殖技術與印記基因疾病

2.1 ART與BWS

BWS綜合征，又稱臍膨出-巨舌-巨體綜合征，是一種先天性過度生長綜合征，主要臨床變現為巨大兒、巨舌、新生兒低血糖、中線腹壁缺損等[21]。據估計BWS的發病率至少為1∶13700[22]。BWS由11p15.5區域母源或父源性印跡基因表達缺陷所致，與BWS相關的染色體印記區域包括：IGF2/H19、CDKN1C/KCNQ1OT1。KvDMR1去甲基化異常會引起KCNQ1QT過度表達，從而導致KCNQ1和受其調節的CDKN1C基因表達下降，而CDKN1C是一種生長抑制基因，表達下降會導致臨床出現過度生長；而H19DMR甲基化會引起BWS疾病[23]。有報道體外人工輔助生育技術授精兒童BWS的發生率較正常授精兒童為高[24-25]。目前發現ART可能會增加BWS發生率，采用ART懷孕的母親產出BWS患兒的機率是4.6%，而正常懷孕產出BWS患兒的機率是0.8%[26-27]。在7例ART出生的BWS患者中，5例是通過ICSI出生的，而檢測發現，有四例發生LIT1基因改變，1例發生H19、LIT1的印記基因異常[28]。

2.2 ART與SRS

SRS綜合征，又稱不對稱身材-矮小-性發育異常綜合征。主要臨床表現為胎兒嚴重宮內及出生后生長發育遲緩、喂養困難、特殊面容、不對稱身材等[29]。關于SRS的病因，目前較明確的兩個分子機制是7號染色體母源單親二倍體（mUDP7）及11p15 ICR1低甲基化。可能為7號染色體上的母體生長抑制因子過度表達以及父源促生長基因低表達或失表達所致[30]。有研究發現SRS的生長受限表型可能涉及igf2等促生長因子的缺失[31]。在普通人群中SRS的發病率為1/50000-1/100000[32]，而法國一項研究了15162例通過ART出生的子代中，出現了6例SRS患兒，發病率較自然妊娠者高[33]。說明ART操作可能會影響該疾病的發病率。

2.3 ART與AS

AS綜合征，又稱快樂木偶綜合征，是一種較為罕見的嚴重神經精神系統疾病。主要臨床表現為發育遲緩、智力低下、孤獨內向、吞咽困難、語言和運動功能障礙、癲癇等癥狀[34]。AS的自然發病率為1/50000～1/24000[35]。AS的發病與染色體15q11-q13區段中SNURF/SNRPN簇中UBE3A基因的異常有關。通常正常人腦組織中的母源性UBE3A基因表達，而父源性的相對沉默[36]。人類15號染色體的母系甲基化印記建立在受精時或之后，在此期間發生印記基因的缺失較多見[37]。而ART技術的操作較多在此時，可能會導致異常的印記建立。一項來自英國的研究發現，75例AS患者中有3例是通過ART出生的，并且這3例AS患者均存在SNRPN印記基因異常，推測與ART相關的AS是由于印記基因的異常甲基化引起的[38]。

輔助生殖技術在為人類克服生殖障礙的價值顯而易見，但是在ART的操作中涉及體外受精、ICSI、胚胎體外培養、超促排卵等關鍵技術，任何一個環節都有可能會干擾印記基因的表達，從而可能會導致印記基因相關疾病。目前ART與印記基因失調所致的疾病的發生機制尚未明確。也有研究提出印記錯誤早就存在于精子或卵細胞中，沒有證據表明IVF/ICSI與印記疾病有必然的因果關系[39]。正是由于ART的應用越來越廣泛，ART對子代的安全性問題將更加值得探究，以便造福人類。