CREB轉(zhuǎn)錄因子磷酸化信號(hào)通路與癲癇的研究進(jìn)展

呂曉民，朱戰(zhàn)鵬， 孫立超

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院 1.神經(jīng)內(nèi)科;2.急診內(nèi)科，吉林 長(zhǎng)春130021)

癲癇為神經(jīng)系統(tǒng)常見疾病，盡管近年來多種抗癲癇藥物迅猛發(fā)展，但仍有30%-40%的癲癇患者對(duì)藥物反應(yīng)差，可并發(fā)記憶力損傷、癲癇猝死、自殺等嚴(yán)重并發(fā)癥，為藥物難治性癲癇[1]。因此需進(jìn)一步加強(qiáng)癲癇的發(fā)病機(jī)制研究。癲癇發(fā)病機(jī)制涉及離子通道、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、突觸與縫隙連接、遺傳、自身免疫、炎癥反應(yīng)等多種因素[2-6]。這些因素并非孤立，彼此聯(lián)系十分密切。近年來研究表明環(huán)腺苷酸反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)磷酸化信號(hào)通路在癲癇發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用，現(xiàn)將研究進(jìn)展做一綜述，同時(shí)癲癇新藥開發(fā)提供理論支持。

1 CREB分子生物學(xué)特點(diǎn)

Montrminy于1986年報(bào)道許多基因啟動(dòng)子含高度保守8堿基回文序列5′-TGACGTCA-3′，且受cAMP的調(diào)節(jié)，稱之為cAMP反應(yīng)元件( cAMP response element,CRE)[7]。Yamamoto于1988年發(fā)現(xiàn)一種分子量為43000的轉(zhuǎn)錄因子，與CRE結(jié)合后使基因轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)，稱之為cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白，簡(jiǎn)稱CREB[8]。CREB由 341 位氨基酸殘基構(gòu)成，C端為天冬氨酸，N端為蛋氨酸。其中堿性亮氨酸拉鏈區(qū)、激酶誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)域區(qū)、α區(qū)為CREB行使轉(zhuǎn)錄因子功能的重要區(qū)域。CREB屬轉(zhuǎn)錄因子亮氨酸拉鏈家族中的一員，C端的第277-341位氨基酸殘基肽段富含大量堿性氨基酸，且亮氨酸重復(fù)出現(xiàn)，稱為堿性亮氨酸拉鏈(basic leucinezipper，bZIP)，該部位與DNA親和力高，為CREB與啟動(dòng)子CRE位點(diǎn)想結(jié)合的部位。CREB以同源或異源二聚體形式與CRE結(jié)合。CREB分子N端第98位至第144位氨基酸殘基的肽段，含有多種蛋白激酶對(duì)CREB進(jìn)行磷酸化的位點(diǎn)，稱為激酶誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)域區(qū)(kinase inducible domain，KID)，這些激酶包括蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)、酪蛋白激酶Ⅱ(Casein KinaseII，CKII)和鈣-鈣調(diào)素激酶IV(Ca2+/calmodulin dependent kinases IV，CaMKIV)等。上述激酶識(shí)別CREB Ser133位點(diǎn)，將其磷酸化形成pCREB而上調(diào)轉(zhuǎn)錄。其他位點(diǎn)Serl42和Serl43磷酸化抑制CREB的轉(zhuǎn)錄活性。此外含大量脯氨酸的PRO區(qū)將bZIP區(qū)與KID區(qū)分離，目的是使兩個(gè)區(qū)域更好地發(fā)揮其作用。α區(qū)是第88位至第101位氨基酸殘基的肽段，呈α螺旋結(jié)構(gòu)，缺乏這一段序列的CREB分子簡(jiǎn)稱為CREBΔα，其調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性較CREB明顯降低，α區(qū)是CREB的轉(zhuǎn)錄功能調(diào)節(jié)的必需片段。

CREB以去磷酸化形式存在于細(xì)胞核中，此時(shí)無活性。目前發(fā)現(xiàn)多個(gè)信號(hào)通路途徑參與CREB的激活。目前以AC-cAMP-CREB信號(hào)通路研究最為廣泛。細(xì)胞膜上G蛋白耦聯(lián)受體與單胺類遞質(zhì)結(jié)合后激活腺苷酸環(huán)化酶(adenylylcyclase，AC)，使細(xì)胞內(nèi)cAMP水平升高，cAMP激活PKA，將CREB Ser133磷酸化形成pCREB。CREB結(jié)合蛋白 (CREB binding protein，CBP)為核因子，與pCREB結(jié)合形成復(fù)合物后才能與靶基因CRE相結(jié)合調(diào)控轉(zhuǎn)錄[9]。其他通路還包括Ca2+-CaMKIV-CREB信號(hào)通路、MAPK-CREB信號(hào)通路及PI3-Akt-CREB信號(hào)通路等。蛋白磷酸酶P1(proteinphosphatase,PP1)與蛋白磷酸酶P2A(proteinphosphatase,PP2A)可以使pCREB去磷酸化則下調(diào)其轉(zhuǎn)錄活性[10]。

CREB是通過磷酸化與去磷酸化的形式來實(shí)現(xiàn)其調(diào)節(jié)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄功能。目前研究表明，CREB磷酸化信號(hào)通路與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化、周期調(diào)控以及學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)。同時(shí)CREB能調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄而改變細(xì)胞興奮性及調(diào)節(jié)突觸可塑性，因此CREB可能參與癲癇發(fā)病機(jī)制。

2 CREB與異常突觸

大量病理證實(shí)，癲癇反復(fù)發(fā)作可以導(dǎo)致異常樹突形成、苔蘚纖維出芽、神經(jīng)元壞死、膠質(zhì)細(xì)胞增生、局部慢性炎癥等，同時(shí)形成異常興奮性環(huán)路構(gòu)成異常突觸，從而進(jìn)一步促進(jìn)癲癇的發(fā)展。研究表明CREB與樹突的生長(zhǎng)發(fā)育、苔蘚纖維出芽密切相關(guān)。Finsterwald等報(bào)道CREB與CREB調(diào)控的轉(zhuǎn)錄共激活因子1(CREB-regulated transcription coactivator，CRTC1)共同介導(dǎo)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)對(duì)樹突發(fā)育的調(diào)控，抑制CREB活性后將消除BDNF對(duì)樹突長(zhǎng)度及側(cè)枝形成的促進(jìn)作用[11]。Redmond等研究表明鈣離子誘導(dǎo)的樹突生長(zhǎng)受CaMKIV與CREB的活性調(diào)控。鈣離子內(nèi)流將激活CaMKIV，CREB為CaMKIV的底物，將其Ser133磷酸化形pCREB，進(jìn)一步調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄合成蛋白質(zhì)，改變神經(jīng)元細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，同時(shí)調(diào)控與樹突相關(guān)蛋白質(zhì)合成促進(jìn)樹突生長(zhǎng)[12]。Li等發(fā)現(xiàn)CREB協(xié)同因子1(transducers of regulatedCREB，TORC1) 與CREB共同調(diào)控神經(jīng)元樹突生長(zhǎng)。磷酸化的TORC1無活性，其活性受鈣離子及cAMP調(diào)節(jié)。當(dāng)鈣離子通過電壓門控鈣離子通道內(nèi)流時(shí)，激活鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶( calcineurin，CN)，磷酸化的TORC1在CN作用下去磷酸化而激活。應(yīng)用TORC1抑制劑或者下調(diào)TORC1時(shí)，在體內(nèi)及體外均發(fā)現(xiàn)樹突生長(zhǎng)受到抑制[13]。因此CREB上調(diào)會(huì)促進(jìn)靶基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元局部細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白合成增加形成苔蘚纖維出芽、異常突觸及異常神經(jīng)環(huán)路，導(dǎo)致抗癲癇藥物失效而形成難治性癲癇。

3 癲癇使CREB表達(dá)增強(qiáng)

多項(xiàng)研究表明癲癇動(dòng)物模型及患者腦組織的CREB表達(dá)較正常腦組織明顯增強(qiáng)。Zhu報(bào)道了匹羅卡品誘導(dǎo)癲癇小鼠，發(fā)作3天后海馬CREB及pCREB水平較對(duì)照組明顯增高，且持續(xù)8周[14]。Guo報(bào)道了30例難治性顳葉癲癇患者，均行3種及以上抗癲癇藥物治療無效而行外科手術(shù)治療，其對(duì)照組為既往無癲癇及其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病的外傷患者，結(jié)果表明TLE組顳葉新皮層pCREB表達(dá)較對(duì)照組明顯增強(qiáng)[15]。Beaumont等研究表明在新皮層癲癇，pCREB及其靶基因均呈現(xiàn)出層特異性分布。CREB于各層均有表達(dá)，但pCREB僅在II層(外顆粒層)及III層(外錐體細(xì)胞層)表達(dá)。靶基因的表達(dá)分成兩種類型[16]。ARC、EGR1與pCREB相同僅限于II、III層中表達(dá)。然而EGR3與NARP，其表達(dá)擴(kuò)展到更深層，不限于II、III層，但其表達(dá)在II、III層最多。其中EGR1基因與人類新皮層癲癇發(fā)作間期棘波頻率密切相關(guān)[17]。這種層特異性的蛋白及基因的表達(dá)可能為癲癇的病理基礎(chǔ)。由以上研究表明CREB轉(zhuǎn)錄因子磷酸化信號(hào)通路參與癲癇的發(fā)病機(jī)制。

4 CREB活性與癲癇

癲癇發(fā)作后CREB上調(diào)及CREB對(duì)海馬神經(jīng)元興奮性調(diào)節(jié)，表明CREB可促進(jìn)癲癇發(fā)生及發(fā)展。Armentia等研究表明當(dāng)CREB磷酸化而激活時(shí)，會(huì)抑制后超極化(afterhyperpolarization，AHP)電流，使持續(xù)表達(dá)CREB轉(zhuǎn)基因小鼠海馬CA1 神經(jīng)元活性增強(qiáng)，甚至出現(xiàn)散發(fā)癲癇樣放電[18]。Zhu等利用CREB Ser133突變成Ala133的CREBIR與CREBΔα轉(zhuǎn)基因小鼠誘導(dǎo)癲癇持續(xù)狀態(tài)及慢性癲癇模型，研究發(fā)現(xiàn)抑制CREB活性將縮短癲癇持續(xù)狀態(tài)持續(xù)時(shí)間，同時(shí)減少慢性癲癇發(fā)作的次數(shù)，但不能縮短慢性癲癇發(fā)作持續(xù)時(shí)間[19,20]。

5 CREB靶基因與癲癇

啟動(dòng)子含有CRE的基因?yàn)镃REB靶基因。目前發(fā)現(xiàn)多種CREB靶基因與癲癇密切相關(guān)，如α1-GABAA、BDNF、COX-2與NMDA等。Hansen一項(xiàng)研究表明在癲癇持續(xù)狀態(tài)及慢性癲癇中，CREB靶基因表達(dá)明顯增強(qiáng)[21]。

5.1 α1-GABAAγ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，其受體分為GABAA、GABAB、GABAC三種。GABA能神經(jīng)遞質(zhì)傳遞減少被認(rèn)為是人類癲癇發(fā)生的病理生理機(jī)制之一。GABA主要作用于GABAA受體，其由多個(gè)亞基構(gòu)成(α1-6，β1-3，γ1-3，δ，ε，π，θ，ρ1-3)。該受體是配基門控氯離子通道受體，其氯離子電導(dǎo)率受GABAA受體結(jié)合因子如地西泮等的調(diào)解。編碼GABAA受體α1亞單位的基因α1-GABAA位于5號(hào)染色體，為CREB靶基因[22]。Lund等應(yīng)用染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)(Chromatin Immunoprecipitation，ChIP)發(fā)現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)小鼠齒狀回pCREB與內(nèi)源性α1-GABAA結(jié)合增強(qiáng)[23]。Hu等發(fā)現(xiàn)CREB的過表達(dá)會(huì)顯著抑制α1-GABAA活性。上述研究表明CREB為α1亞單位表達(dá)的重要調(diào)節(jié)因子[24]。

5.2 BDNF腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF除參與神經(jīng)生長(zhǎng)、分化過程外，還調(diào)節(jié)神經(jīng)突觸傳遞，其受體為酪氨酸受體激酶B(tyrosine receptor kinase B，TrkB)。當(dāng)BDNF與TrkB結(jié)合時(shí)。TrkB受體激活能使神經(jīng)元快速去極化，加強(qiáng)興奮性突觸傳遞、降低抑制性突觸傳遞，使神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)高度持續(xù)興奮，為構(gòu)成癲癇發(fā)作的病理基礎(chǔ)。研究表明BDNF與CREB相互作用，即BDNF激活CREB轉(zhuǎn)錄，反過來CREB與BDNF基因的CRE結(jié)合促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄[25,26]。Zhu等的研究發(fā)現(xiàn)含有CREBΔα轉(zhuǎn)基因小鼠匹羅卡品誘發(fā)癲癇持續(xù)狀態(tài)后48小時(shí)，其海馬部位BDNFexon IV mRNA較對(duì)照組表達(dá)下降[19]。

5.3 COX-2環(huán)氧化酶2(Cyclooxygenase，COX-2)是花生四烯酸代謝過程中前列腺素(prostaglandins，PGs)合成的限速酶。人類COX-2 基因定位于1號(hào)染色體的1q25.2-q25.3,全長(zhǎng)8.3kb，由10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成，編碼604個(gè)氨基酸殘基組成的多肽。在5′端轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游含一些轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，如NF-κB位點(diǎn)、TATA box、CRE等。目前認(rèn)為COX-2與炎癥、腫瘤等密切相關(guān)，因諸多炎癥介質(zhì)參與癲癇發(fā)病過程，因此認(rèn)為炎癥反應(yīng)為癲癇發(fā)生發(fā)展的重要因素之一[27]。Lee等研究發(fā)現(xiàn)，在含有CREB抑制基因A-CREB的轉(zhuǎn)基因小鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)模型中，COX-2的表達(dá)減弱，表明CREB可誘導(dǎo)COX-2的表達(dá)[28]。

5.4 NMDA谷氨酸為神經(jīng)系統(tǒng)重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，其受體主要可以分為兩大類：

N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartic acid receptor,NMDA)與α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid receptor,AMPA受體)。NMDA受體為谷氨酸主要受體。目前研究認(rèn)為神經(jīng)系統(tǒng)興奮性遞質(zhì)與抑制性遞質(zhì)失衡是癲癇發(fā)病機(jī)制之一。在癲癇發(fā)作中，NMDA受體含量增多，表達(dá)升高，谷氨酸與NMDA結(jié)合后鈣離子通道開放，鈣離子內(nèi)流導(dǎo)致神經(jīng)元興奮性增加產(chǎn)生癲癇樣放電。NMDA受體是一種分布在突觸后膜上的離子通道蛋白，是一種異聚體，由NR1、NR2、NR3 3種亞基組成，每個(gè)受體至少由2個(gè)NR1亞基和2個(gè)NR2亞基組成。NR2亞基分為NR2A、NR2B、NR2C、NR2D 4種亞型，其中NR2B與學(xué)習(xí)記憶、疼痛等密切相關(guān)。NR2B基因含800個(gè)堿基對(duì)，5′端406-413位點(diǎn)的堿基對(duì)為CRE[29,30]。Rani研究發(fā)現(xiàn)CREB激活形成pCREB可以使小鼠神經(jīng)元NR2B上調(diào)[31]。

癲癇發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，但CREB是否直接參與目前尚不明確。做為細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子的CREB在諸多細(xì)胞傳導(dǎo)通路的激活下，調(diào)節(jié)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄水平，調(diào)控突觸可塑性及細(xì)胞興奮性。因此抑制CREB活性的策略可能對(duì)于治療癲癇有效。隨著 CREB 研究的深入，其不僅可能成為癲癇診斷、篩查、預(yù)后的重要標(biāo)志物，同時(shí)也有可能成為癲癇新藥物個(gè)體化治療的新靶點(diǎn)。