負壓創面療法治療創面銅綠假單胞菌感染的研究進展

余清文，羅小波，劉道宏*

1.解放軍總醫院第八醫學中心骨科，北京 100091 2.解放軍總醫院骨科，北京 100853

銅綠假單胞菌(pseudomonas aeruginosa，PA)是創面感染的常見細菌之一，常見于大面積燒傷、嚴重創傷、糖尿病足、壓瘡或免疫功能低下的患者。最新研究數據顯示PA感染在感染創面中占比高，而且有逐年上升趨勢[1-2]。PA感染在創傷后8 h內即可在創面形成生物膜，其引起的創面炎癥反應強于金黃色葡萄球菌[3]，感染創面面積更大，病程更長，致殘率、致死率更高，是阻礙慢性感染創面愈合的首要致病因素[4]。負壓創面療法(negative pressure wound therapy，NPWT)又被稱為負壓封閉引流(vacuum sealing drainage，VSD)[5]或負壓輔助閉合(vacuum-assisted closure，VAC)[6]，是近20年來創面治療領域的最大創新。臨床應用以來，在世界范圍內對各種創面處理產生了重大影響，也被廣泛用于治療PA感染創面，目前已經成為處理創面、控制感染、促進愈合的重要手段之一。且對于NPWT控制PA感染的作用機制，目前也有了較深入的研究。本文敘述了近些年負壓封閉引流治療PA感染創面的最新研究成果，對其研究機制進行匯總和分析，并探討了進一步研究的方向。

1 細菌數量的變化

開放創面常伴有細菌污染，創面感染的進展與細菌數量相關，因此細菌數量一直是感染創面治療研究中的基本檢測指標。國內外諸多學者將NPWT應用于各種感染性軟組織損傷的治療，取得了良好的效果[7-9]，但對于PA和其它不同菌屬清除效果不盡相同。Mou?s等[10]在臨床隨機對照研究發現：與傳統換藥相比，VAC能夠顯著促進感染創面的縮小與修復，但細菌總量卻增加了，其中金葡菌顯著增加，而非發酵革蘭氏陰性菌減少。Sheppard等[11]對34例肢體開放性戰創傷行VAC治療的患者進行研究發現：傷后每周從活組織培養細菌(>105CFU/g)的發生率為28%(第1周)，31%(第2周)和37%(第3周)，其中假單胞菌僅在第1周出現2例，占所有總數的3.7%，VAC確實能減少假單胞菌數量。

為了研究NPWT對PA的清除作用，學者們還做了深入的實驗研究。Lalliss等[12]進行了感染性軟組織損傷合并開放性骨折的動物實驗，結果顯示NPWT治療能夠顯著減少PA，而對金葡菌并無清除作用。VAN Hecke等[13]比較了普通非黏性敷料與聚乙烯醇和聚氨酯敷料結合NPWT對馬尸體腹部肌皮瓣創面體外的抗菌作用，發現在進行12 h處理之后，NPWT-聚乙烯醇敷料組的PA的細菌數量在每個時間點顯著低于其他組，NPWT組的PA細菌數量均低于無負壓治療的非粘性敷料組。

盡管臨床研究在研究對象、創面類型、感染細菌的種類、處理步驟和研究方法等方面都缺少一致性，但結果表明NPWT與細菌生長動力學之間存在復雜的關系，表現出菌屬選擇性抑制的特點，能夠抑制包括PA在內的非發酵革蘭陰性菌的增殖[14]。因此，最大限度控制干擾因素的實驗研究結果更為可信，來自這些研究的數據進一步證實了NPWT能夠選擇性抑制假單胞菌屬的結論。在早期研究中，作者認為NPWT增加創面血流量，改善了氧合作用，增強了受損組織對感染的抵抗力，進而提高了細菌清除率；他們推測局部組織氧合作用的增加會減少厭氧菌的生長，增強中性粒細胞的氧化爆發來而破壞細菌[6]。在使用消除了免疫系統影響的離體模型研究中，同樣觀察到PA數量的減少，說明NPWT的物理作用能夠改變細菌生長的微環境，從而抑制PA的增殖[13,15]。

2 對生物膜的作用

PA極易形成保護菌落聚集體的生物膜。成熟的生物膜不但幫助PA逃避免疫系統，還可阻止外源性抗菌物質進入，為細菌提供有利的繁殖環境，是慢性感染形成及難以治療的關鍵因素[16]。在PA導致持續慢性感染時，大量中性粒細胞的趨化集中，并非完全有利于PA的清除。相反，源于中性粒細胞的肌動蛋白和DNA所形成聚合物，利于PA早期生物膜的形成[17]。PA生物膜的存在會誘發持續低效的炎性反應，阻礙組織修復并加重損傷，無法成功地進入增生性階段及再上皮化或重塑階段，導致創面難以愈合[3]。

隨著研究的深入，學者們進一步就NPWT對創面內PA生物膜的作用進行了探索。2012年，Ngo等[15]應用體外模型觀察到NPWT能夠壓縮PA生物膜厚度，并縮短生物膜的擴散距離。Phillips等[18]采用豬皮體外感染生物膜模型，發現間歇負壓引流結合不同消毒液沖洗，可以有效裂解PA生物膜的胞外聚合物基質，殺傷生物膜內的細菌。Tahir等[19]同樣采用體外模型研究消毒液或抗菌藥物溶液沖洗及聯合NPWT沖洗的效果，認為單獨應用NPWT能通過降低生物膜厚度和質量來改變生物膜結構，聯合聚維酮碘和聚六亞甲基雙胍抗菌溶液沖洗可以進一步發揮協同效應，減少生物膜活細菌的數量。還有學者研究了單獨應用聚氨酯敷料或載銀微粒聚氨酯敷料，及與NPWT聯合應用對體外生物膜細菌模型的作用，發現在沒有負壓作用的情況下，兩種敷料均不能顯著減少PA的數量，而NPWT結合載銀微粒聚氨酯敷料對生物膜細菌具有顯著的協同殺傷效應，掃描電鏡證實僅有少量稀疏PA生物膜殘留，在3 d、5 d后均能完全滅活細菌[20]。

由于生物膜結構特性和研究方法的局限，目前對于NPWT對PA生物膜作用的探索以體外實驗研究為主。NPWT通過海綿敷料可以將體外負壓轉化為對創面正壓力，這一物理作用能夠壓縮生物膜結構，反映在生物膜厚度和擴散距離的降低[15]。而在間歇負壓循環模式下，海綿敷料網狀開孔結構產生宏觀形變和微形變的剪切力可以充分改變生物膜胞外聚合物的基質結構，能增強殺菌消毒液和抗菌藥物對生物膜的滲透，進而分離或滅活生物膜內細菌，游離出來的細菌在隨后的負壓引流中被清除[18]。而NPWT與載銀敷料的協同殺菌效果也說明，NPWT通過物理作用破壞生物膜結構，是銀粒子能夠穿透生物膜殺傷細菌的基礎[20]。體外研究的數據可能基于缺乏臨床相關性的實驗室方法，在臨床使用時能否轉化為相同的療效或結果，需要通過深入進行動物模型或臨床研究進行驗證。

3 細菌毒力的變化

PA分泌的各種毒素也是破壞創面組織和阻礙愈合的因素之一，其中外毒素A、鼠李糖脂和彈性蛋白酶是主要毒力因子。外毒素A是一種相對分子質量66 000的酶，可以阻止細胞蛋白合成，導致組織壞死[21]。鼠李糖脂具有熱穩定的細胞外溶血特性，可快速導致多形核細胞壞死，阻礙機體免疫系統對細菌的清除作用[22]。彈性蛋白酶能導致組織損傷和炎癥，降解基質蛋白、血漿蛋白及補體C3，還能抑制成纖維細胞生長[23]，彈性蛋白酶既可以破壞軟組織、阻礙免疫清除作用，又可以抑制創面組織修復過程。此外，PA中還存在著群體感應(quorum sensing，QS)系統，其中結合3-氧十二烷酰高絲氨酸內酯(3-O-C12-HSL)的Las系統和結合丁基高絲氨酸內酯(C4-HSL)的Rhl系統都在皮膚和創面感染中發揮作用，可調控各種毒力因子的分泌[24]。

Wang等[25]在2016年首次報道了NPWT產生的體外負壓環境對PA毒力因子的影響，發現相對于正常大氣壓下，負壓作用24 h后PA分泌的外毒素A，鼠李糖脂和彈性蛋白酶顯著減少；其毒力因子、Las和Rhl群體感應系統的基因相對表達也明顯下調。之后他們又以兔耳軟組織損傷模型進行了相關的動物實驗，在NPWT治療6 d后，外毒素A、鼠李糖脂、彈性蛋白酶和生物膜毒力因子eDNA(extracellular DNA)均顯著減少，病理結果顯示NPWT治療后上皮和肉芽組織間隙顯著改善，同時新生上皮和肉芽組織明顯增加[26]。

普遍認為PA是一種條件致病菌，自身的毒力及侵襲性相對較弱，因此NPWT治療對PA毒力影響的相關研究極少。NPWT的抽吸和引流作用可以排出來自創面、細菌和滲出物的毒素，這是創面內細菌毒素減少的機制之一[27]。其次，毒力因子基因表達的下調也可導致毒力因子合成的減少。目前已有研究表明，抑制PA的QS系統可減少毒力因子的表達，控制感染[28]。抑制QS系統可能是其影響細菌增殖發育，降低毒力侵襲的作用途徑之一，但其內在機制有待深入研究。

4 炎癥反應的調控

臨床研究證實，負壓治療環境能夠影響炎癥反應。Labler等[29]發現，在使用VAC治療軟組織開放性創面的引流液中IL-8顯著升高，活組織病理中可見嗜中性粒細胞的聚集。Karam等[30]的研究亦表明，應用NPWT可明顯減少創面引流液中TNF-α的含量。Eisenhardt等[31]發現，NPWT可顯著減少CD68+巨噬細胞的組織浸潤，并減少IL-1β和TNFα的表達。結果提示NPWT能夠通過免疫調節作用，抑制或降低炎性反應的強度，降低持續炎癥帶來的自身損害，有利于感染控制與創面修復。

PA感染創面常表現為持續低效的炎性反應，阻礙組織修復并加重損傷，甚至引起膿毒血癥[3]。Liu等[32]以小鼠燒傷感染PA敗血癥為模型，檢測了治療期間IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10和TNF-α的血清濃度，在治療3 d后，還對受傷的皮膚，肺，肝和腎組織進行了組織病理學檢查，結果顯示：與干濕紗布換藥相比，NPWT降低了細菌數量和血清內炎癥因子濃度、避免了重要臟器的損傷，減少了膿毒血癥，降低了實驗動物的死亡率。由此認為NPWT通過限制細菌增殖和減輕敗血癥進展來有效地降低炎癥程度。

Wang等[25]進行的動物實驗檢測了創面局部IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的表達，以及創面不同深度層面的中性粒細胞計數，發現NPWT可以抑制創面局部炎性因子過度表達，進而降低創面炎癥反應程度。這一現象的可能機制有：負壓的物理環境對創面細胞的生理活動有所改變，從而對炎性因子的表達產生影響；NPWT可以將創面的分泌物以及非定植細菌及時引流至體外；炎性因子表達的減少，減弱了對中性粒細胞的趨化作用，從而緩解感染狀態下的過度炎癥反應。但目前，NPWT負壓環境對PA感染創面炎癥反應的調控機制，以及免疫細胞功能狀態，尚未見深入的研究報道。

5 抗菌效果的改進

隨著對負壓治療機制認識的深入和材料學的不斷發展，NPWT系統也在不斷改進中。Ngo[15]發現NPWT結合載銀敷料，可在24 h內迅速減少PA的數量。對比常規的NPWT，持續2周治療，也無法達到相同的療效；而單用載銀敷料，也無法達到結合NPWT的治療效果。Stinner等[33]采用羊腿復合創傷感染模型，也得到了同樣的結果，而且驗證該治療方案對金黃色葡萄球菌也能產生顯著作用。

另一種改進是NPWT結合消毒劑或抗生素治療。Moch[34]使用聚乙烯醇海綿作為藥物載體，對13例急性創面感染和14例慢性創面感染的患者進行治療，取得較單純NPWT更好的療效。Rand等[35]使用了結合殼聚糖涂層的海綿敷料，作為抗生素的緩釋載體，結果顯著優于采用單一的NPWT治療開放性骨折污染模型。其他學者使用體外模型觀察NPWT聯合應用不同類型消毒劑如1%聚維酮碘溶液、0.1%聚六亞甲基雙胍、0.05%葡萄糖酸氯己定和抗生素如慶大霉素1 μg/mL、利福平24 μg/mL灌洗對成熟生物膜內的PA的影響，發現聯合治療組能夠有效降低細菌數量，而單用消毒劑灌注沖洗組，對膜內細菌數量基本改變[18-19]。

現有研究表明NPWT應用載銀敷料對慢性創面中PA具有顯著殺傷作用，但在臨床應用中還需要評估許多重要問題，例如患者的年齡，創面的部位，以及是否會導致毒性的累積。對于聯合消毒劑或抗生素灌洗治療的研究，研究結果存在著較大差異，諸如不同研究采用不同的菌屬，不同的灌洗溶液，灌洗液在創面內停留的時間不同。目前對組織修復的影響程度及負壓值調整標準等也尚未形成統一觀點。

6 總結與展望

負壓創面療法(negative pressure wound therapy，NPWT)以其獨特的作用機理和不同于傳統治療的理念，已形成一套新的治療方案。NPWT控制感染的機制盡管尚不完全明確，但大量研究表明能夠有效減少PA的數量。同時，體外及動物實驗支持NPWT能夠壓縮PA生物膜厚度和質量來改變生物膜結構，而間歇負壓模式能夠裂解其基質結構，需要進一步的臨床實驗證實。對于PA在負壓作用下的毒力變化，僅有個別研究探索，卻為PA細菌毒力研究拓展了思路。PA感染的炎癥反應轉歸直接影響到組織是否能夠修復再生，NPWT能夠抑制慢性炎癥反應并無明顯爭議，其作用途徑值得深入探索。此外，對于NPWT聯合其他抗菌治療仍缺乏具體的臨床應用性指導，包括如何選擇合適的敷料、灌洗溶液的類型、最佳負壓的設置及更換間隔等。對NPWT治療銅綠假單胞菌感染創面機制原理的深入研究和闡釋，使其在臨床上得到更科學有效的應用，也為諸多基礎研究拓展了方向。