環狀RNA對心血管疾病的影響

劉人可 曾研 彭道泉

環狀RNAs(circular RNAs，circRNAs)是競爭性內源性RNAs領域，甚至整個RNA領域中的研究重點，其特征是5’端和3’端連接形成環狀獨特結構。天然circRNAs已被證實是一種豐富、穩定、多樣和保守的RNA分子，在RNA的相互作用網中起著不可或缺的作用。通過測序技術，在真核細胞中發現了豐富的circRNAs。大量研究表明其是一種具有較多的功能的內源RNA，具有微小RNA的海綿功能，可在剪接中參與線性RNA競爭；也能在調節轉錄的環節起到作用[1]。此外，circRNAs被證實涉及許多疾病的發生和發展過程，其在心血管疾病的作用已成為研究熱點[2]。

1 CircRNAs的發現和分布

CircRNAs是一組“古老”而又“新鮮”的非編碼RNA分子(non-coding RNA，ncRNA)，于1976年在植物病毒中被發現。近年來，高通量測序技術的突破，發現認為circRNAs廣泛存在于真核細胞中，包括蒼蠅、哺乳動物和人類。2013年，Hansen等[3]發現circRNAs的重要作用。越來越多的研究表明，circRNAs參與疾病起始和進展，可作為新的臨床診斷和預后標志物。

2 CricRNAs的合成

2.1 剪接體依賴性環化途徑。

大多數真核生物circRNAs在選擇性剪接過程中產生，由機械剪切力或Ⅰ/Ⅱ組核酶催化。反向剪接反應的加工需要規范剪接體，circRNAs是一種能夠調節剪接和催化環化形成的順式調節元件[3-4]。雖然具體的機制未知，相對合理的解釋認為隨著剪接小核核糖(splicing nuclear RNA，snRNPs)在前體信使RNA上的連續組裝，外顯子的下游5’供體部位與上游3’受體位點相結合催化circRNAs合成。與經典的剪接相比，反向剪接的效率非常低，可能是因為反向剪接不利于剪接體的組裝。

2.2 內含子配對驅動環化和套索驅動環化途徑。

在“內含子配對驅動環化”過程中，大量的circRNAs依賴于內含子反向互補的模體，互補的片段兩端分別是GU富集片段和C富集片段，兩者首尾相連，形成的circRNAs能避免被RNA酶水解。而原始轉錄中的供體與受體配對可使5’端至3’端緊緊相連，促進外顯子的環化。套索驅動環化由量個外顯子組成的剪接供體共價結合，切除中間所有內含子形成的circRNAs。經典的跳讀外顯子跳躍導致鎖狀結構的產生，是這個模型的關鍵并可以促進外顯子的環化。

3 CircRNAs的功能

3.1 微小RNA的“海綿”功能

CircRNAs是一種新型的競爭性內源性RNAs，作為微小RNA的“海綿”，它能與其結合并通過堿基互補配對反向調節相關微小RNA。已知微小RNA與靶向信使RNA的非翻譯區(3’UTR)的互補位點結合，抑制蛋白翻譯，或促進信使RNA轉錄后的降解[5]。CircRNAs可調節微小RNA靶基因的活性，在調控轉錄后水平上發揮間接的作用，影響微小RNA的生物學功能。CiRS7(circular RNA sponge for miR-7，ciRS-7)是最近確定的人類circRNAs，其擁有超過70個常規的微小RNA7結合位點，因此被稱為miR7的超級“海綿”[1，6]。CiRS7與小鼠腦中的微小RNA7共表達，特別是在大腦皮質和海馬神經元中。通過促進核酸外切裂解實現，其可有效抑制微小RNA7活性、導致微小RNA7靶向轉錄水平的增加，抑制微小RNA與其介導靶點之間的穩定性[7]。

3.2 轉錄后調節

大多數由內含子形成的circRNAs位于細胞核中，幾乎無微小RNA結合功能。但有研究發現，敲除circRNAs后可阻止相應基因的轉錄[8]。CircRNA circ-ankrd52位于與其相關基因的轉錄起始區，并可促進RNA聚合酶Ⅱ的功能。初步證明，circRNAs的功能是促進相應基因的轉錄。因為某些circRNAs具有RNA聚合酶Ⅱ結合位點，它可通過結合RNA聚合酶Ⅱ，調節選擇性剪接和轉錄過程[8]。EIciRNA(exonic-intronic circRNA)由外顯子和內含子合成，也主要定位在細胞核中，對轉錄進行調控。U1snRNP(small nuclear ribonucleic proteins)是U1小核RNA剪切時用到的一種小核RNA，可相互作用，通過相互結合增強親本基因的表達[6]。CircRNAs可與RNA結合蛋白(RNA binding proteins，RBPs)形成復合物，抑制轉錄或通過WatsonCrick堿基配對原則，直接調控信使RNA的表達[7]。許多其他含有翻譯起始位點的circRNAs也具有類似的功能。因此，對基因轉錄過程的調節是circRNAs一個重要的功能。

3.3 翻譯水平的調節

研究證明，在真核細胞中若環狀mRNA含有可直接與核糖體結合的“內部核糖體進入位點”(internal ribosome entry site，IRES)序列，被翻譯。而真核生物核糖體40S亞基無論在體外或體內，一旦在入口點與circRNAs結合后就能夠啟動翻譯。此外，Naoko等[9]發現，在大腸桿菌無細胞翻譯系統中，含有無限開放閱讀框(open reading frame，ORF)的circRNAs也可被翻譯產生蛋白質。其他研究表明，將含有綠色熒光蛋白的開放閱讀框連接入circRNAs中，可在大腸桿菌中成功轉錄綠色熒光蛋白[10]。一些circRNAs可在活的人類細胞中翻譯，不受常規翻譯啟動中必不可少的第三部分的影響，比如內部核糖體進入部位、polyA尾或帽結構等。此外，circRNAs可通過類似于聚合酶反應的滾環擴增(rolling circle amplification，RCA)的方式在真核轉譯系統中進行蛋白質合成。無需與RNA模版多次結合，circRNAs不僅可產生長重復序列，還可在一定時間段內達到比其線性RNA更高的生產力[9]。EIciRNAs可對mRNA進行狙擊，通過隔離轉錄起始點的方法減少線性RNA的翻譯。EIciRNA形成時可發生可變剪接，線性RNA缺少翻譯起始點而無法進行翻譯[11]。因此，存在于人類細胞中的外顯子circRNAs的翻譯比先前想象的更有可能。但僅外源性circRNAs才能在真核細胞中編碼蛋白質，迄今無直接證據能證明天然真核內源性circRNAs可被翻譯。

3.4 環化過程影響選擇性剪接

通常，circRNAs被認為是蛋白質編碼基因剪接過程的特殊功能性副產物。大部分circRNAs都是外顯子。因此circRNAs的形成過程可能會影響相關preRNA-RNA前體的選擇性剪接，導致基因表達的改變。RNA結合模體蛋白20(RNA binding motif protein，RBM20)，對于源自Titin基因I帶的circRNAs亞型的合成至關重要。在RBM20敲除小鼠中，最初源自circRNAs合成的外顯子在線性RNA中更加濃縮[12]。因此，被環化的外顯子越多則其對應的信使RNA的外顯子越少。雖然還未發現內源性的circRNAs可被翻譯成蛋白質，但可推測某些基因剪接相關蛋白的過表達或缺失也可通過影響circRNAs來調節信使RNA的合成，進一步調節基因表達。

4 CircRNAs與心血管疾病

最近的幾項研究顯示，circRNAs可能在心血管疾病的發生和發展中起重要作用。

4.1 心臟相關RNA(heart-related RNA，HRCR)對心臟病理性肥大和心力衰竭的作用。

內源性調子因子微小RNA223可誘導心臟肥大和心衰。凋亡抑制因子ARC在心肌細胞肥大和凋亡中起保護作用，微小RNA223通過調節下游靶點ARC發揮病理作用[13]。CircRNAs可作為微小RNA的“海綿”與微小RNA結合并影響其表達。Wang等[14]證實，心源性circRNA HRCR可以通過直接結合微小RNA223，抑制微小RNA223的活性，誘導ARC表達的增加，抑制心肌細胞和心臟肥大和心力衰竭。CircRNAs可能為臨床上有價值的心力衰竭生物標志物，但需廣泛的驗證和研究[13]。

4.2 CircRNA Cdr1as可誘導心肌梗死的發生和發展。

心肌梗死(myocardial infarction，MI)是冠狀動脈急性、持續性缺血缺氧所引起的心肌壞死，可并發心律失常、休克或心力衰竭，常危及生命。在MI發展過程中，長時間的心肌缺血缺氧促進心肌細胞的凋亡。ZNF292作為鋅指結構域的轉錄因子在內皮細胞高度表達，cZNF292為內皮細胞中由缺氧誘導并表達的circRNAs。在缺氧內皮細胞中，cZNF292水平升高有助于內皮細胞的形成，而circRNAs參與調控低氧心肌內皮細胞功能[15]。轉錄因子SP1和聚ADP核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase，PARP)能促進細胞凋亡，是微小RNA7的下游靶向基因[16]，微小RNA7通過負向調節PARP的表達，抑制缺氧情況下的細胞凋亡，發揮心肌保護作用。Zhao等[7]發現，Cdr1as作為circRNAs的一種，可起到微小RNA7“海綿”作用，抑制微小RNA7的活性。Cdr1as通過與微小RNA7a直接結合，降低微小RNA7a的活性，上調miR-7靶向基因(如PARP和SP1)的表達，加重心肌細胞損傷。

4.3 CircRNA cANRIL與動脈粥樣硬化風險密切相關

全基因組關聯研究(genome-wide association study，GWAS)發現，INK4/ARF基因位點附近的9p21染色體的單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)與粥樣硬化性血管疾病有關，表明9p21.3染色體與粥樣硬化性血管疾病的易感性相關。Liu等[14]證實，粥樣硬化性血管疾病相關的9p21染色體SNP可以調控INK4/ARF的表達(INK4a：細胞周期蛋白依賴性激酶4抑制劑；ARF：可變閱讀框)。CircRNA ANRIL(cANRIL)是來自INK4/ARF基因位點的反義轉錄物，INK4/ARF位點附近的9p21.3染色體上的SNP可通過調控ANRIL的剪接和cANRIL合成，調控INK4/ARF的轉錄。因此，INK4/ARF轉錄過程中的選擇性剪接可影響cANRIL的結構和表達。由于cANRIL可通過PcG復合物招募影響PcG介導的INK4/ARF沉默，Burd等[17]推測，cANRIL的結構修飾可使PcG介導的INK4/ARF沉默和動脈粥樣硬化易感性改變。因此，cANRIL與動脈粥樣硬化風險程度有關。研究發現，氧化低密度脂蛋白誘導的人臍靜脈內皮細胞中hsa_circ_0003575表達上調，并在功能驗證實驗揭示了hsa_circ_0003575沉默，在氧化低密度脂蛋白誘導的人臍靜脈內皮細胞中有促進血管內皮細胞增殖和血管生成的作用[18]。這些發現都將為動脈粥樣硬化血管內皮細胞損傷提供新的治療策略。

4.4 CircRNA Circ-Foxo3誘導心臟細胞的衰老表型

Circ-Foxo3衍生自轉錄因子Foxo3，是叉形頭轉錄因子家屬成員(Foxo)的circRNAs，其在老年小鼠和患者的細胞質中高度表達[19]。研究證明，細胞中circ-Foxo3的高表達使細胞周期停滯在G1期，且不能進入到S期。Du等[19]發現circ-Foxo3的表達可抑制細胞增殖和細胞周期進程，且異位表達的circ-Foxo3與衰老相關蛋白ID1和E2F1以及應激相關蛋白低氧誘導因子1α(hypoxia-induced factor 1a，HIF1α)和黏附斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)結合。由于HIF1α(應激蛋白)和FAK(應激蛋白)對衰老產生負面影響，細胞質中circ-Foxo3的數量增加導致通過阻斷細胞質中ID1、E2F1、HIF1α和FAK，抑制此類蛋白質在細胞核中的水平，促進細胞的衰老表型，為抑制心臟衰老和心肌保護方面提供了潛在的新治療方法。

4.5 新發現

AKT是絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶，影響細胞增殖轉錄和凋亡。PDK1(phosphoinositide dependent kinase 1)為3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1。兩者通常分布在細胞質中，異位表達的circ-Amotl 1通過與AKT1和PDK1形成三元化合物，促進AKT與PDK1的結合，誘導AKT磷酸化和pAKT核易位，增強細胞存活，抑制凋亡。CircRNA- circ-Amotl 1優先表達在新生兒心臟組織中，異位表達circ-Amotl 1可提高細胞存活率，減少細胞凋亡。與對照組相比，多柔比星處理后小鼠心臟功能明顯降低，通過腹腔注射circ-Amotl 1促進其表達，可治療甚至消除多柔比星的心臟毒性。在細胞核中，pAKT通過直接磷酸化正向調節增殖相關的因子、并負向調控促凋亡蛋白的表達[20]。外源性circ-Amotl1的表達可減少心肌細胞纖維重建，增加心肌細胞的抗凋亡能力，削弱多柔比星誘導的心肌纖維重建，對心功能起到保護作用。總之，這些都為心肌損傷修復提供新的干預靶點和治療策略[21]。

5 展望

目前我們對circRNAs的了解和探索尚未成熟，與心血管疾病相關的circRNAs更是少之又少。相信我們會發現更多與心血管疾病相關的circRNAs及其作用機制，為心血管疾病診斷及治療提供新的思路和治療靶點。

利益沖突：無