鈉氫交換蛋白1及其抑制劑的研究進展

馬嘉琪 陳章煒 錢菊英

鈉氫交換蛋白[sodium hydrogen exchange protein(Na+/H+exchanger)，NHE]是一種離子轉運蛋白。1976年，Murer等[1]首次報道了存在于大鼠小腸和腎臟微絨毛結構中的NHE。至此，已發現10種NHE異構體，即NHE-1至10[2-3]。其中，NHE-1主要分布于心肌細胞膜上，NHE-2至4主要分布于腎臟及胃腸道細胞膜，NHE-5分布于大腦細胞膜，NHE-10分布于破骨細胞膜[3]，而不同于前幾種異構體，NHE-6至9則主要分布于胞內膜結構[4]。

NHE-1可通過使心肌細胞外鈉離子與細胞內氫離子1∶1交換，調節細胞內pH值，維持細胞容積，同時在心肌細胞生長等過程中也發揮著重要作用[4-5]。研究已證實，NHE-1 在多種心血管疾病中，尤其是心力衰竭、心肌肥厚、冠心病等的發生、發展中起著重要作用。本文將就NHE-1的蛋白結構、生物學功能及其在心血管疾病中的變化及病理生理學機制做一綜述。

1 NHE-1的結構及功能

NHE-1蛋白分子量為90 000，糖基化后分子量為110 000，由815個氨基酸組成[6]。其包含兩個功能結構域：一部分為-NH2端(N-端)，是由500個氨基酸組成的12次跨膜結構，主要發揮跨膜離子轉運功能，是介導一個胞外Na+與一個胞內H+互相交換的充分必要結構；另一部分是-COOH 端(C-端)，是由315個氨基酸組成的胞內結構，為胞漿內通過蛋白激酶誘導的磷酸化等方式進行功能調節的區域[7]。

NHE-1蛋白的活性受多種胞內外因素的影響而改變，各種結合蛋白或生物活性物質與胞內結構域結合以激活或抑制NHE-1的功能。NHE-1的C-端含有細胞內質子調節位點[8]、絲氨酸/蘇氨酸的磷酸化/脫磷酸化位點以及多個NHE相關功能蛋白結合位點。現有研究證實，鈣離子結合蛋白、蛋白激酶、磷酸酶及一些細胞骨架蛋白均可與NHE-1胞內結構特定結合位點相互作用[9-13]。

2 NHE-1的生理學及病理生理學作用

Grinstein等研究發現，當細胞遭受某些刺激因素后，細胞內pH值一旦下降，便可激活NHE-1，使其發揮Na+/H+交換作用，從而使細胞內pH值盡快恢復正常，在糾正了細胞內酸中毒的同時提高了Na+水平。由此，證實了NHE-1主要在pH值變化時發揮作用[14-15]。而在缺血缺氧時，細胞產生ATP不足，不能通過正常的Na+/K+交換將NHE-1轉移入胞內的Na+轉移至胞外，細胞內Na+水平顯著升高。這可進一步激活Na+/Ca2+反向轉運，使細胞外Ca2+大量轉移至細胞內，導致細胞內Ca2+超載[16-18]。眾所周知，Ca2+超載是眾多細胞病理過程的啟動因素，通過激活絲裂原活化蛋白激酶家族等細胞信號轉導途徑，導致細胞損傷、肥大、凋亡、腫脹和纖維化以及氧自由基大量產生等病理生理過程的發生。

此外，NHE的激活還與細胞增殖、分化、細胞骨架形成和細胞遷移有關。NHE突變的細胞在通過G2-M檢查點時顯著延緩，進而導致增殖能力下降[19]。另有研究發現，抑制NHE-1可影響P19細胞的分化[20]。NHE-1基因敲除小鼠雖可成活，但其生長及生存率均明顯低于野生型[21]。在腫瘤細胞中，NHE-1還可調控細胞的遷移及上皮間質轉化[22]。

3 NHE-1與心血管疾病

3.1 NHE-1與心肌缺血再灌注損傷

研究表明，NHE-1在心肌缺血再灌注損傷中發揮著重要作用。正如前文所述，NHE-1與胞內pH值的穩定密切相關。在正常的生理狀態下，胞內pH值正常，NHE-1活性很弱。而當心肌缺血缺氧時，心肌細胞內無氧糖酵解增多，導致細胞內H+明顯增多，繼而激活NHE-1，促進H+/Na+交換，使細胞內Na+水平顯著升高[23]。當心肌細胞恢復供血供氧后，細胞外pH值恢復，加之缺血期細胞產生的各種活性物質的激活作用，NHE-1活性迅速增加，使得更多的Na+大量涌入細胞內。此時，細胞內高濃度的Na+將使鈉鈣交換蛋白進行反向運輸，Na+轉移至胞外，Ca2+轉移至胞內，導致細胞內Ca2+超載進而造成心肌細胞損傷[16-17]。因此，心肌缺血再灌注損傷并不是NHE-1直接作用的結果，而是其導致的細胞內鈣超載造成的[24]。在多種缺血再灌注動物模型中均已證實，NHE-1抑制劑具有保護作用[25-27]。此外，NHE-1也參與了缺血預適應對心肌細胞的保護作用[28]，這也反證了NHE-1在缺血再灌注損傷中的重要促進作用。

3.2 NHE-1與心肌肥厚和心力衰竭

NHE活性提高也可直接造成心肌肥大和心力衰竭。NHE-1的活性不僅受細胞內pH值調控，同時也受各種激素、旁分泌和自分泌細胞因子以及機械牽拉作用的調控。α受體激動劑、血管緊張素Ⅱ和內皮素1這些可明確導致心肌肥厚的因子均可調控NHE-1活性[29-31]。這提示了NHE-1在心肌肥厚過程中的調控、促進作用。轉基因過表達NHE-1的小鼠表現出了明顯的心肌肥大和心力衰竭[17]，深入研究其機制發現，在轉基因小鼠的心肌細胞中，Na+和Ca2+均較野生型升高，而轉基因小鼠的心肌收縮力也隨之下降。在原代心肌細胞中過表達NHE-1，可發現活化T細胞核因子(nuclear factor of activated T cell，NFAT)的核內轉移。另有研究在NHE-1轉基因小鼠中發現，眾多與NFAT相關的microRNA存在表達差異[32]，一定程度上表明了NHE-1可通過調控NFAT促進細胞肥大。在多個心肌梗死、轉基因和心肌肥厚動物模型研究中，NHE-1抑制劑均可改善心肌肥大和心臟功能[33-35]，更加驗證了NHE-1與心肌肥厚和心力衰竭密不可分。

4 NHE-1抑制劑的基礎研究

基于NHE-1在各種心血管疾病中的促進作用，那么NHE-1抑制劑是否可以發揮保護作用呢？Amiloride是第1個被發現的NHE抑制劑，其原本是一個保鉀利尿劑，后被發現具有抑制NHE-1的作用，不僅可抑制鈉通道，還可抑制鈉鈣交換蛋白。研究顯示，Amiloride可有效提高大鼠缺血再灌注心肌的心室修復，減少肌酶釋放[36]。但是，Amiloride為非選擇性NHE-1抑制劑，后續通過調整Amiloride的分子結構得到了新的NHE抑制劑，如HOE-694、Cariporide和Eniporide等，均為苯甲酰胍類藥物，可與NHE跨膜區(M4和M9為最重要的結合區域)結合，改變NHE構型，從而發揮抑制作用。該類藥物沒有抑制鈉鈣交換蛋白和鈉離子通道的作用，因此特異性更強、不良反應更少。其中，Cariporide和Eniporide對NHE-1的選擇性較好[37]。

一系列有關NHE-1抑制劑的動物實驗研究已在心臟疾病方面有了重大發現。在狗心肌缺血再灌注模型中，結扎前降支前15 min給予Eniporide可明顯減少心肌梗死面積[26]。而Zoniporide同樣可減少兔心肌缺血再灌注后的梗死面積，且其保護作用較Eniporide和Cariporide更好[27]。在同一模型中，分別于缺血前及再灌注前給予BIIB-513，也得到了同樣的結果，同時也減少了心律失常發生率[38]。在大鼠心肌缺血再灌注模型中，單獨使用5 μM Cariporide可顯著延長竇性心律時間，減少缺血再灌注所造成的心律失常[39]。一項有關保存供體心臟的研究表明，在停搏液中加入Cariporide可減少心臟復跳后心肌細胞的壞死和凋亡[40]。而在豬模型中，合用NHE抑制劑和碳酸氫鈉可減少窒息引起的心臟驟停[41]。

5 NHE-1抑制劑的臨床試驗

針對NHE-1特異性抑制劑——Cariporide和Eniporide，已有多個中心進行了規模不等的臨床研究，然而結果并不盡如人意(表1)?？傮w來說，NHE-1在臨床應用上并未顯示出如動物實驗中的良好效果，同時其嚴重的不良反應也不容忽視[42]。

表1 NHE-1抑制劑的臨床研究匯總

注：NA：不適用；PTCA：經皮冠狀動脈腔內血管成形術；UA：不穩定型心絞痛；NSTEMI：非ST段抬高型心肌梗死；PCI：經皮冠狀動脈介入治療；CABG：冠狀動脈旁路移植術

5.1 Rupprecht等的研究

Rupprecht等[43]進行的一項小規模、多中心、隨機、對照的臨床研究，納入了100例ST段抬高型心肌梗死接受直接冠狀動脈成形術的患者。于再灌注治療前，51例患者使用安慰劑，49例患者接受40 mg Cariporide靜脈彈丸式注射。分別于術前及術后21 d評估心室功能和心肌受損程度。結果顯示，Cariporide組患者的心臟射血分數較高(50% 比 40%，P<0.05)，左室收縮末容積較小(69.0 ml 比 97.0 ml，P<0.05)，心肌的運動障礙區域及心肌酶譜升高程度也均明顯小于安慰劑組。

5.2 ESCAMI研究[44]

雖然前述研究證實了在再灌注前給予NHE-1抑制劑可減少心肌梗死面積，但在接下來的大規模臨床試驗——ESCAMI(Evaluation of the Safety and Cardioprotective effects of eniporide in Acute Myocardial Infarction)研究中，卻得到了與之不同的結果。

ESCAMI研究納入癥狀持續大于30 min的急性ST段抬高型心肌梗死患者，且均于發病6 h以內給予了再灌注治療(溶栓或冠狀動脈成形術)。研究分為兩個階段：第1階段納入了5個國家的433例患者。為了確定最佳用藥劑量，首先于再灌注前10 min內緩慢注射不同劑量的Eniporide(50、100、150和200 mg)或安慰劑。結果顯示，50和200 mg治療組與安慰劑組比較無明顯優勢，但在100和150 mg治療組中心肌壞死面積明顯減少。因此，將100和150 mg用于試驗的第2階段；第2階段納入10個國家的978例患者，重復前述試驗過程。但結果卻顯示，與安慰劑組相比，無論是100 mg還是150 mg Eniporide治療組的心肌梗死面積、臨床預后均無明顯改善。

有趣的是，在發病4 h以后接受再灌注治療的亞組分析中發現，150 mg Eniporide可明顯減少患者發病1周后的心力衰竭發生率(11.1% 比 21.9%，P=0.02)。

5.3 GUARDIAN研究[45-46]

GUARDIAN(During Ischemia Against Necrosis)是一項國際性針對Cariporide應用于不穩定性心絞痛、非ST段抬高型心肌梗死、血管成形術或CABG高風險人群的Ⅱ期/Ⅲ期臨床研究。共納入11 590例患者，每8小時分別給予不同劑量藥物(4組平行對照組：20、80和120 mg Cariporide以及安慰劑)直至PCI或CABG術前2 h，利用靜脈泵入方法，給藥時間約為1 h。總體來說，研究并未發現Cariporide可減少全因死亡率或心肌梗死發生率。然而在120 mg亞組中發現，總體事件率下降了10%，尤其是在接受CABG的患者中，死亡和心肌梗死發生率下降達25%之多，其中非致死性心肌梗死發生率下降了32%，但仍需進一步研究證實。

5.4 EXPEDITION研究[47]

EXPEDITION(sodium-hydrogen Exchange inhibition to Prevent coronary Events in acute cardiac conDITION)是一個雙盲、隨機對照的Ⅲ期臨床研究，其主要研究目的是驗證Cariporide在高風險CABG患者中的心肌保護作用?；颊哂诼樽砬? h開始給藥，首先給予180 mg負荷劑量，然后給予40 mg/h持續24 h，再給予20 mg/h持續24 h，整個給藥時間持續約49 h(如患者體重<50 kg，則改為負荷劑量后20 mg/h維持48 h。研究發現，Cariporide組患者CABG術后死亡和非致死性心肌梗死的總相對風險明顯減少(16.6% 比 20.3%，P=0.0002)。

但是，Cariporide的益處主要表現在術后非致死性心肌梗死發生率的減少(14.4% 比 18.9%，P<0.001)，而Cariporide組術后死亡率確有所升高(2.2% 比 1.4%，P=0.02)?？紤]死亡率升高的最主要原因是血栓栓塞性卒中所致的腦血管事件，可能與NHE-1調控血小板活化有關[49]。

雖然Cariporide致卒中的不良反應嚴重阻礙了其臨床應用，但同時也明確了Cariporide在接受CABG術的患者中有著明顯的心肌保護作用。

5.5 Fleisher等的研究

Fleishe等[48]的最新研究探討了NHE抑制劑Zoniporide能否減少非心臟血管手術患者圍術期的心臟缺血事件。共納入769例具有冠心病高危因素的擬行非心臟血管手術患者，于術前60 min給予負荷劑量并維持靜脈用藥至術后7天(4個平行對照組，分別為3、6和12 mg·kg-1·d-1Zoniporide組和安慰劑組)。最終術后30 d復合終點(死亡、心肌梗死、充血性心力衰竭、心律失常)發生率在安慰劑組和各劑量組無明顯差異，考慮可能原因至少部分是因為在此過程中并未發生過心肌缺血再灌注。

6 小結

盡管有關NHE抑制劑的基礎研究證實了其有心肌保護作用，但目前多個大規模臨床研究的結果不盡如人意。我們應采用辯證的方法來仔細審視這些研究結果，從中發現研究中的不足以便改進，尋找最適宜的人群及藥物劑量、給藥方法等，充分發揮其心肌保護作用。

利益沖突：無