試驗(yàn)設(shè)計(jì)及其在中藥新藥研究中的應(yīng)用

廖禹程 翁琰 石小鵬 孫蓮 文愛東（通訊作者）

（1 空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科 陜西 西安 710032）

（2 新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院 新疆 烏魯木齊 830011）

中藥新藥（new Chinese medicine）以中醫(yī)理論為指導(dǎo)，以綜合臨床療效為出發(fā)點(diǎn)，運(yùn)用天然藥物研究的基本原理和方法，開發(fā)和研究中藥新藥。開發(fā)中藥新藥，應(yīng)注意了解臨床需要、市場(chǎng)短缺或未飽和的藥物，并根據(jù)臨床需要選擇劑型。同時(shí)，我們應(yīng)該密切關(guān)注藥物狀況和政策法規(guī)。中藥由于其獨(dú)特的保健特點(diǎn)、毒副作用小、治療費(fèi)用低廉，非常適合在OTC市場(chǎng)銷售。

1.正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)(Orthogonal exPerimental design)是基于正交性，從全面試驗(yàn)中選擇一些有代表性的點(diǎn)。這些代表點(diǎn)具有“均勻分散，整齊可比”的特征，“均勻分散”只要通過(guò)這部分試驗(yàn)，就能反映全部全面試驗(yàn)情況，所以使試驗(yàn)點(diǎn)具有代表性。“整齊可比”可用數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行處理，在只考慮一個(gè)因素的影響時(shí)，其他因素的影響可以抵消。

正交試驗(yàn)法優(yōu)點(diǎn)：

（1）試驗(yàn)點(diǎn)具有代表性，試驗(yàn)次數(shù)很少。

（2）可以在不重復(fù)測(cè)試的情況下估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差。

（3）可以分清因素的主次。

（4）采用數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提出預(yù)測(cè)條件。

正交試驗(yàn)法不足：

正交試驗(yàn)適用于水平數(shù)不多的實(shí)驗(yàn)。如果一項(xiàng)試驗(yàn)中有s個(gè)因素，每個(gè)因素各有q水平，并且通過(guò)正交試驗(yàn)來(lái)安排，則至少需要q2個(gè)試驗(yàn)。當(dāng)q較大時(shí)，q2將更大，使實(shí)驗(yàn)者望而生畏。對(duì)這種類型的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，均勻設(shè)計(jì)非常有用。

均勻設(shè)計(jì)又稱均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)法（Uniform Design ExPerimentation），均勻設(shè)計(jì)就是只考慮試驗(yàn)點(diǎn)在試驗(yàn)范圍內(nèi)均勻散布的一種實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，也是通過(guò)一套精心設(shè)計(jì)的表來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的。

均勻試驗(yàn)法的特點(diǎn)

（1）每個(gè)因素的每個(gè)水平都只進(jìn)行一次試驗(yàn)，這大大降低了試驗(yàn)次數(shù)。

（2）任兩個(gè)因素的試驗(yàn)點(diǎn)在平面的格子點(diǎn)上，每行每列有且僅有一個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)。

（3）均勻設(shè)計(jì)表任兩列組成的實(shí)驗(yàn)方案通常不相同，所以每個(gè)均勻設(shè)計(jì)表必須有一個(gè)附加的使用表

（4）隨著因素的水平數(shù)增加，試驗(yàn)次數(shù)按水平數(shù)的增加量而增加。

（5）用計(jì)算機(jī)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，方便、準(zhǔn)確、快速地求解定量回歸方程。分析各因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，可對(duì)優(yōu)化條件進(jìn)行定量預(yù)報(bào)及對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果區(qū)間估計(jì)進(jìn)行優(yōu)化。

試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果分析

目的：選出各因素最佳水平以形成優(yōu)選的實(shí)驗(yàn)方案。確定每個(gè)因素對(duì)指標(biāo)影響的主要和次要關(guān)系。方法：對(duì)于正交試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行直觀分析和方差分析。對(duì)于均勻設(shè)計(jì)結(jié)果，通常使用多元回歸分析。將統(tǒng)計(jì)結(jié)果與生產(chǎn)實(shí)踐相結(jié)合，進(jìn)行綜合分析，以確定最佳的提取工藝條件。最后，還應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，無(wú)驗(yàn)證試驗(yàn)的優(yōu)選結(jié)果沒(méi)有價(jià)值。

正交設(shè)計(jì)應(yīng)用舉例：

正交試驗(yàn)法優(yōu)選芪葛顆粒的提取工藝

（1）定因素：根據(jù)目的和文獻(xiàn)調(diào)研，預(yù)實(shí)驗(yàn)確定為芪葛顆粒的加水量、提取時(shí)間和提取次數(shù)三個(gè)因素。

（2）劃水平：分別選取加水量（8倍、10倍、12倍）提取時(shí)間（30min、60min、90min）提取次數(shù)（1次、2次、3次）三個(gè)水平。

（3）選正交表：采用L 9(3 4)正交設(shè)計(jì)

（4）橫著做試驗(yàn)：因素位于表頭，水平對(duì)號(hào)入座→試驗(yàn)，并記錄試驗(yàn)效應(yīng)的指標(biāo)數(shù)值。

（5）數(shù)據(jù)處理：選擇每個(gè)因素的最佳水平以形成優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)方案。確定每個(gè)因素對(duì)指標(biāo)影響的主要和次要關(guān)系。方法有直觀分析和方差分析。直觀的結(jié)果表明，影響綜合得分順序大小的因素是：C(提取次數(shù))＞A(加水量)＞B(提取時(shí)間)方差分析表明，只有煎煮次數(shù)對(duì)綜合評(píng)分有顯著影響，加水倍數(shù)和煎煮時(shí)間均無(wú)顯著影響[17]。雖然提取時(shí)間對(duì)提取量沒(méi)有明顯影響，但黃芪甲苷和葛根素的提取量隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。結(jié)合上述分析結(jié)果，最終提取工藝條件為：A3 B1 C3，即加入12倍水，提取3次，每次30 min[17]。

（6）驗(yàn)證試驗(yàn)：取3倍處方量藥材3批，按最佳提取條件提取。結(jié)果顯示黃芪甲苷的含量為0.590 mg.ml-1(n=3),葛根素的含量為8.248 mg.ml-1,(n=3)，表明各成分提取均較完全，且重復(fù)性良好，本研究確定的最佳提取工藝切實(shí)可行、可操作性強(qiáng)[17]。

正交試驗(yàn)法優(yōu)選天麻提取工藝研究：

(1)定因素：根據(jù)目的和文獻(xiàn)調(diào)研，預(yù)實(shí)驗(yàn)確定提取過(guò)程中乙醇濃度、溶媒用量、提取次數(shù)為三個(gè)因素。

(2）劃水平：分別選取乙醇濃度（60%70%80%）溶媒用量（6倍8倍10倍）提取次數(shù)（2次3次4次）三個(gè)水平。

（3）選正交表：采用L 9(3 4)正交設(shè)計(jì)

（4）橫著做試驗(yàn)：因素位于表頭，水平對(duì)號(hào)入座→試驗(yàn)，并記錄試驗(yàn)效應(yīng)的指標(biāo)數(shù)值，采用HPlC法測(cè)定天麻中天麻素含量。

（5）數(shù)據(jù)結(jié)果：天麻素在0.1428～0.7140μg(r＝0.9994)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率為100.01%，RSD為1.04%[16]。結(jié)果顯示，每種提取因素均對(duì)天麻素的提取率和提取出膏率有影響，乙醇濃度對(duì)天麻素提取率和天麻提取物出膏率的影響是主要因素，且對(duì)出膏率影響較顯著，以60%乙醇提取效果最佳。綜合考慮，最終選擇6倍量60%乙醇回流提取2次，以獲得最佳的天麻提取工藝[16]。

（6）驗(yàn)證試驗(yàn)：稱取3份天麻藥材，每份8.0 g，精密稱定，并根據(jù)上述測(cè)定的天麻最佳提取工藝分別提取，并測(cè)定了天麻素的提取率和天麻提取物的出膏率[16]。工藝驗(yàn)證結(jié)果表明，通過(guò)本試驗(yàn)確定的提取工藝提取出的天麻素提取率較高、工藝穩(wěn)定[16]。

均勻設(shè)計(jì)應(yīng)用舉例：

均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選干姜超臨界萃取物微囊制備工藝：

（1）提取指標(biāo)的測(cè)定：以載藥量、包封率為指標(biāo)。

（2）提取工藝的均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)：采用均勻設(shè)計(jì)對(duì)囊芯與囊材比例（x1）、進(jìn)風(fēng)溫度(x2)、進(jìn)液速度（x3）進(jìn)行考察并進(jìn)行綜合評(píng)分。使用綜合評(píng)分法，綜合評(píng)分=載藥量×100/最大載藥量×權(quán)重0.8＋包封率×100/最大包封率×權(quán)重0.2，按照U 5(5 4)表安排試驗(yàn)，進(jìn)行3因素5水平的均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)[11]。

（3）數(shù)據(jù)處理：得回歸方程：Z=73.9905－7.5882χ1+0.1930χ2-1.3263χ3(P=0.024 8，r=0.999 2)，結(jié)果可信。在z值取最大時(shí)，χ1=1：1.1、χ2=159.5、χ3=7.5。綜合生產(chǎn)情況，選擇囊芯物和囊材比例為1：1.1，進(jìn)風(fēng)溫度為160℃，進(jìn)液速度為8 mL.min-1[11]。

（4）驗(yàn)證試驗(yàn)：取處方量藥材3份，分別優(yōu)選工藝制備微囊，測(cè)定各指標(biāo)并進(jìn)行評(píng)價(jià)。得到的總得分在預(yù)測(cè)區(qū)間內(nèi)，表明優(yōu)選的工藝是穩(wěn)定且可行的。

黨參多糖提取工藝優(yōu)化及不同購(gòu)買地黨參多糖含量比較：

（1）提取指標(biāo)的測(cè)定：使用葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算多糖的濃度。多糖提取率=多糖濃度×待測(cè)液體積／藥材粉末質(zhì)量[12]。

（2）提取工藝的均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)：采用U6(3×63)均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選擇影響多糖提取較大的4個(gè)工藝參數(shù)，分別為溫度、液料比、提取時(shí)間和超聲功率，并比較10種不同購(gòu)買地黨參多糖含量[12]。

（3）數(shù)據(jù)處理：得多元回歸方程為：y=0.338X4-0.002χ2×χ4－8.369.其中，χ1為提取溫度，χ2為液料比，χ3為提取時(shí)間，χ4為功率.R2=0.963，結(jié)果顯著(F=39.484，P=0.007)，說(shuō)明回歸模型有效[12]。從回歸方程可以看出，提取功率對(duì)黨參多糖提取率的影響最大，液料比與提取功率產(chǎn)生的交互作用次之，提取溫度與提取時(shí)間在選定范圍內(nèi)對(duì)回歸方程沒(méi)有影響，為獲取最高提取率使得X4最大選擇135 W[12]。χ2×χ4最小即使得χ2為25，綜上分析結(jié)合單因素結(jié)果得到最佳優(yōu)化工藝為提取溫度70℃，提取液料比為25：1，提取時(shí)間為35min，提取功率為135 W，預(yù)期多糖提取率為30.51%[12]。

（4）驗(yàn)證試驗(yàn)：分別以上述最佳工藝，提取多糖3次。提取率分別為31.86%，31.19%，30.74%，其平均得率為31.26%，相對(duì)誤差為0.024，接近理論值，表明上述均勻設(shè)計(jì)結(jié)果的可靠性[12]。

2.討論

試驗(yàn)設(shè)計(jì)越簡(jiǎn)單、無(wú)交叉，大生產(chǎn)可行性越大。所以，在制定試驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)，應(yīng)將實(shí)際情況考慮進(jìn)去。使其具有可操作性，安全性大。同時(shí)，生產(chǎn)成本也是我們需要考慮的一個(gè)關(guān)鍵因素，減少一個(gè)操作單元或包裝的成本，則可大大降低工業(yè)化生產(chǎn)成本。將各方面因素綜合考慮，通過(guò)合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)制定更貼近實(shí)際生產(chǎn)的工藝路線。使中藥新藥的研究不僅僅是實(shí)驗(yàn)室研究，而真正能滿足臨床需要。

3.結(jié)語(yǔ)

綜上，在中藥新藥的研究中，我們必然會(huì)遇到試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案的確立和用數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法處理數(shù)據(jù)的問(wèn)題。在設(shè)計(jì)上，我們應(yīng)該根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件提前制定合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案。在數(shù)據(jù)處理上，切不可拿到數(shù)據(jù)再考慮統(tǒng)計(jì)方法。這樣做無(wú)異于亡羊補(bǔ)牢，為時(shí)晚矣。合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法能幫助我們?cè)趯?shí)驗(yàn)時(shí)做到心中有數(shù)，節(jié)省時(shí)間，提高效率，結(jié)果可靠。在中藥新藥的研究中起到了至關(guān)重要的作用。