豬精液冷凍關鍵技術的研究與分析

龍清孟，毛世明，周 迪，陳光侯，龔 菲，李 平，李 俊，朱寬峰，金穗華

[1.貴州省種畜禽種質測定中心，貴州 貴陽 550018；2.北京田園奧瑞生物科技有限公司，北京 海淀 100089；3.農業部牛冷凍精液質量檢測中心（南京），江蘇 南京 210095]

近年來，使用豬的原精，經過稀釋處理，開展人工授精配種技術，在養豬業中得到廣泛推廣應用，這一技術具有自然交配不可比擬的優點：1）可以提高良種公豬利用率，加速品種改良；2）解決了豬場存在一定程度母豬自然交配的困擾：如公、母豬體格相差太大，母豬不堪負重；3）解決了某些地方品種的母豬生殖道本身的生理特征不利于自然交配，精液容易倒流等問題；4）可擴大優秀公豬在時間和地域上的利用率，為優秀種豬精液的資源共享提供便利條件，尤其適用地勢險要的貴州農村山區，村寨之間、鄉鎮之間由于交通不便，不便于趕公豬開展自然交配；5）人工授精還可以有效防止公、母豬受到多種疫病接觸傳染的可能。然而采用豬的常溫精液（原精稀釋處理）輸配，在一定程度上受到時間、空間距離的限制，常溫精液保存期一般在3～5 d，常溫精液不便于長途運輸及途中控溫等缺點，無法充分發揮場與場之間優秀種公豬精液的資源共享，因此，目前豬人工授精技術在養豬生產實踐中，已經從采用常溫精液輸配技術，逐漸轉移到凍精制作和凍精解凍輸配技術上。

現階段，豬精液的冷凍制作及保存關鍵技術研究受到了全球養豬業重視和關注，我國豬冷凍精液的研究雖然在技術上已經取得了一定的突破，但是也有很多研究報道了豬的冷凍精液制作在技術上還有待進一步完善[1]。由于豬精子的生物學特性，其精液冷凍制作技術要求不完全與牛、羊的冷凍精液制作技術相同，主要是豬精子在冷凍、解凍過程中更容易受到損傷。因此，深入系統地研究豬精液冷凍機理和生產過程的關鍵技術，探討影響豬凍精活力及受精能力的因素，進一步改進豬精液冷凍技術及操作方法，已成為國內外種豬育種生產中渴望解決的急迫問題[2]。目前，國內豬精液冷凍工藝流程基本相同，只是在關鍵技術環節的具體操作方面各有差異。本研究就目前國內現狀，提出有關豬精液冷凍的一些關鍵技術要點與質量控制等六方面的關鍵技術環節的見解，以供同行參考。

1 嚴把原精（新鮮精液）質量關

豬冷凍精液質量的好壞除了受冷凍技術的影響外，還與原精質量密切相關。較多的試驗證明，不是每頭公豬的原精液或是每一次采集的精液所制作出的凍精，都可以保證得到滿意的冷凍效果。按照精液冷凍工藝要求，對于采精公豬（品種、年齡和個體間存在差異）或采集的精液（質量評估）是具有一定的選擇性，選擇強度要求視所在地區的基礎統計確定，通常對于老齡公豬、精液不耐凍的公豬不列為制作凍精對象。其次，精液采集技術是關鍵，精液采集過程中如果采精員不按標準操作要求（采集前清潔衛生、采集保留中段精液，前段及后段精液棄掉），可對原精質量帶來不利影響，直接影響后續的凍精制作質量，因此，這就要求采精人員的操作熟練、規范，使公豬能夠得到充分射精，并把握好精液采集過程，棄去最初（近20%、少精子）和最后（可達40%、膠狀凝塊為主）的無用精液[3]。原精品質檢測：要求外觀色澤正常乳白色，稍微帶一點腥味，無臭味，不允許有膿性分泌物及其他臟污，檢測精子密度≥2億/mL，活率≥90%，活力≥80%，畸形率≤10%。豬原精品質好與否是直接影響凍精制作成功與否的決定性因素，因此豬凍精的前提，必須嚴把原精源頭質量關。

2 稀釋液

稀釋液不僅是作為擴大精液量的填充成分，更重要的是可對稀釋后精子發揮保護作用。通常，稀釋液的主要成分均是按照精液（精子）的生物、物理學特性與需要來配制，各畜種間存在差異。

2.1 糖類

以馬和豬的精液來說，其稀釋液補充糖類似乎較牛、羊的精液更為重要[4]。目前認為就種畜精液常用的保存液中添加糖類主要有：乳糖、蔗糖、葡萄糖、果糖、海藻糖等，普遍認為以果糖為佳[5-6]，實際生產中因果糖價格的昂貴，多數仍以使用蔗糖、葡萄糖為主，有的使用果糖只是作為適量添加。李震鐘等[7]研究表明，在豬凍精稀釋液中，添加2%～4%葡萄糖效果較好，濃度過高對精子的頂體有損害作用；Paulenz等[8]研究發現添加乳糖的效果比蔗糖和果糖好；李青旺等[9]低濃度的葡萄糖（2%～3%）與乳糖（2%～3%）混合使用效果很好；0.05%可溶解性氮-乙酰-D-氨基葡萄糖的稀釋液冷凍豬精液，能夠顯著提高凍精解凍后的精液活力和頂體完整性[10]。

2.2 緩沖物質、非電解質

Tris（三羥甲基氨基甲烷）不僅與檸檬酸鹽、磷酸鹽作為常用的緩沖劑保持精液適當的pH，并且對于精液的冷凍具有良好作用，很多養豬業發達國家在制作豬的凍精時，使用的冷凍稀釋液中都含有 Tris[7]；OEP（Orvus Es Past）是一種含有十二烷基硫酸鈉（SDS）的復合物，適宜濃度的OEP能夠顯著提高豬凍精解凍后的精子活力和頂體完整性（P＜0.05）[11-14]。在稀釋液中添加適量合成洗滌劑Tris、OEP（Orvus Es Past/Equex Stm）、CNB（安鈉咖）等，對解凍后的精子活力、活率、質膜與頂體的完整性和存活時間等有不同程度的保護作用[10]。研究資料表明，副性腺體分泌物的電離度，比附睪精液可能高10倍，這樣常常會使豬精子在短時間內失掉電荷而發生凝集現象[4]。為此，在精液稀釋液中加入非電解質物質以緩和副性腺體分泌物的電離程度，常用的非電解質物質除各種糖類外，甘氨酸作為一種極弱的電解質對豬的精液稀釋過程中有良好作用[4]。

2.3 防凍害保護劑

卵黃對精子的保護作用，是其所含脂蛋白、卵磷脂類物質可以防止遭受精子冷休克。卵黃中的膽固醇與精子的存活力有關，有助于精子的存活[15]。不僅如此，卵黃的作用如同獨特的滲透緩沖器作用一樣，存在時可大幅減少高滲性的糖和鹽溶液對精子的有害影響[16]。卵黃應來源于健康雞場的新鮮雞蛋，稀釋液中添加量一般控制在10%～20%之間為宜，加入后應進行充分混勻。特別提醒，在有氧條件下，卵黃中某些氨基酸經酶系統的作用后，可能產生對精子有害的過氧化氫，因此，稀釋液必須強調是現配現用。

不可否認，甘油仍是目前家畜精液冷凍的首選抗凍劑，甘油所具有的理化特性，可以保護和減緩精子在冷凍、解凍過程中越過冰晶危險區域（0～-60℃）易受到傷害。不同畜種的精液，在稀釋后所需的最終甘油濃度有所不同。目前豬凍精制作中，大多數研究使用甘油的濃度在3%左右，姜興剛等在豬精子冷凍技術研究中表明：甘油濃度為2%或4%時，平衡60 min冷凍復蘇后精子活力最高[17]。甘油在精液冷凍過程中對精子既有保護的一面，甘油（Glycerol）為滲透性冷凍保護劑，在溶液中容易結合水分子，發生水合作用，使得溶液的黏性增加，降低了冷凍時水的結晶過程，從而達到保護精子的作用；又有毒害的一面，甘油對精子頂體有嚴重損害，會對精子細胞膜造成傷害[18-19]，甘油對精子具有濃度依賴性毒性，這種毒害的發生機理究竟是什么，至今解釋仍不夠清晰。但有一點是清楚的，甘油的添加可引起稀釋液滲透壓的升高[20]，從而造成精子細胞的蛋白質變性，導致細胞膜結構的損傷，形成對精子的損傷。有學者稱這種現象為“滲透損傷”[21]。最終甘油濃度發生變化引起滲透壓的變化，影響了精液凍后活力和Ⅰ類頂體完整率[22]。基于公豬精子的生物學特性，在精液冷凍關鍵技術上，應采取繼續降低甘油濃度。Polge（1976）之所以在532頭青年母豬中獲得75%受胎率，只是很簡單的用了葡萄糖-卵黃液，著重抓了3個關鍵環節：一是低甘油（1%），二是快速冷凍，三是快速解凍[23]。

2.4 其他添加成分

金穗華等的試驗證明，在牛冷凍精液解凍液中添加了咖啡因，在37℃環境溫度保存，經檢測，結果頂體完整率試驗組均高于對照組（P＜0.01），生存指數雖然高于對照組但差異不顯著[24]。豬冷凍精液稀釋液中添加咖啡因，精子活力試驗組顯著高于對照組（P＜0.05），頂體完整率試驗組同樣顯著高于對照組（P＜0.05）[25]，顯然，適量的咖啡因對于精子的生理活動具有一定的影響，但在實際輸精配種過程中，添加了咖啡因的精液受精的效果還有待進一步的驗證。當然，不排除有的添加咖啡因是出于商業目的。

稀釋液中可以添加乙二胺四乙酸（EDTA）類的保護劑，尤其在凍精制作過程中，一定程度上起到了保護精子抗冷休克作用。

此外，在精液中添加激素，主要是為了使母畜機體發生有利于受精作用的變化。鑒于催產素能引起子宮平滑肌收縮，世文等[26]、徐美芳等[27]及羅旭芳等[28]曾在精液內加入催產素，結果提高了受胎效果。前列腺素（Prostaglandin,PGs）也具有刺激平滑肌收縮的作用。使用同批號牛冷凍精液，在解凍液中添加了前列腺素 F2α（prostaglandin F2α，簡寫 PGF2α）的配種試驗，結果試驗組（n=96）的受精率顯著高于對照組（n=120）20.8%（P＜0.01）。從理論上分析，前列腺素可引起子宮的收縮，有利于精子的運行。而且可能刺激卵泡壁基底部的平滑肌收縮，導致卵泡壁破裂，卵子釋放[29]。

2.5 稀釋液的配制

稀釋液配制過程中，使用的試劑要求是分析純，使用時應精準稱量，配制用水為雙重蒸餾水或超純水，甘油在低溫黏稠情況下采取水浴加溫變稀，以便取量準確，并可用適量稀釋液反復沖洗盛甘油容器，避免粘留，保證準確添加量。抗菌素現配現加，每一類稀釋液配制完成后分別貼上醒目的文字標簽。此外，為確保稱量天平的準確性，要求稱量天平應在檢定周期內，天平應定期檢定。

使用商品稀釋劑的應嚴格按照說明書的要求配制稀釋液，過期或出現潮解、變色的不能使用。

3 溫度影響的關鍵環節

與牛比較，豬精子對于溫度的變化特別敏感。降溫過程中會使精子遭到冷休克影響，導致精子的某些生理變化，并與精子活力和受精力有相關聯系[3]。為了避免這樣的溫度打擊，不僅需要稀釋液中添加應有的各類保護成分，同時還應注意到稀釋溫度與降溫的速率。

3.1 涉及溫度的主要環節

豬精液冷凍工藝流程中基本上有11個技術環節涉及到溫度條件：原精液活力檢測→原精液稀釋自然降至室溫→轉入恒溫箱（17℃）中恒溫保存→17℃環境條件離心→棄上清液、等溫添加無甘油稀釋液→置低溫柜（3～5℃）降溫、平衡→平衡溫度下添加含甘油稀釋液→平衡溫度下封裝細管精液→置入冷凍程序儀器進行精液冷凍→細管凍精分裝保存→細管凍精解凍→解凍后精子活率質量檢測分析。

3.2 技術要點

3.2.1 活力檢測 涉及到精液活力的檢測，顯微鏡載物臺的溫度應控制在37～38℃環境條件下，載玻片、蓋玻片也應預先加溫。往往因為溫度較低影響精子前向運動的速率，導致活力評估失準，影響后續工作質量。

3.2.2 精液稀釋 涉及到添加稀釋液的應采用等溫稀釋，根據精液溫度調節稀釋液溫度，不得反向操作，精液與稀釋液溫差不得超過1℃，加液量要準確，添加時要沿管（杯）壁緩慢加入，并輕輕沿一個方向搖動，混合均勻。使用前，稀釋液可以提前放置在恒溫水浴箱中預熱。

3.2.3 降溫、平衡 涉及到降溫的均應按照工藝規定的控制時間，采取水浴方式可以減緩降溫速度。應用時可按照大約每2～3 min下降1℃[3]。如果需要適當提高降溫速率，可采用在水浴中添加冰塊的方法加速降溫。平衡時，低溫柜中的溫度必須穩定在3～5℃。按工藝流程已實施降溫處理的精液，一定杜絕精液出現溫度回升，哪怕是短暫的回溫時間也決不允許。

3.2.4 封裝、冷凍 封裝也有稱灌裝，目前多使用細管分裝一體機，一次完成細管分裝、封口和印刷標志的一體化操作。通常，封裝是在平衡低溫柜中進行，該期間環境溫度仍應保持在3～5℃，不得回升。封裝后的細管精液需要放置在同溫度條件（3～5℃）的托架上，其碼放的方向，棉塞端靠近操作者，超聲波封口端遠離操作者，放入冷凍箱時同樣如此放置。冷凍箱提前預冷至同等溫度（3～5℃），程序冷凍儀擺放盡量靠近平衡低溫柜，上架后的細管精液從平衡柜轉移至程序冷凍儀的操作務必迅速，減少精液在空中暴露時間，及時關閉程序冷凍儀的箱蓋，然后用程序冷凍儀進行冷凍。參考冷凍曲線4℃至1℃降溫速率1.5℃/min，1℃至-140℃降溫速率30℃/min，-140℃維持約5 min，然后取出精液浸入液氮。

冷凍儀是由電子計算機控制的全自動冷凍設備，可根據試驗研究的需要，設計并獲取多條冷凍溫度曲線。使用時首先選擇電腦中設置的豬精液冷凍最佳溫度曲線，精液冷凍和解凍過程的溫度原則上是快速通過冰晶危險區域（0～-60℃），精液冷凍溫度控制在-140℃左右，初凍溫度調節至4℃，控制2 min降至1℃，控制4.7 min內降至-140℃，并在超低溫-140℃維持約5 min，冷凍全過程應在10～12 min之內完成。冷凍完成后，迅速打開冷凍儀的箱蓋，迅速將冷凍箱連同細管凍精一起浸沒在首先已經盛滿液氮的泡沫箱中，然后在泡沫箱的液氮界面下，將細管凍精分裝入布袋或拇指管（注意在液氮界面下操作），分裝完畢后，并迅速轉移到液氮罐提筒中保存，注意完全浸泡在液氮面下。提醒：在裝入布袋或拇指管時，注意將細管凍精的超聲波封口端向上，棉塞封口端向下，不得倒置（以避免細管棉塞端的爆脫）。

3.2.5 凍精解凍質檢，稀釋輸配

（1）每頭豬的凍精細管中取1支進行解凍，采用50℃水浴解凍15～16 s后取出，用吸水紙或紗布擦干水珠，再用剪刀剪去細管兩端將精液移至10～15 mL的離心管中，按照10倍稀釋量，加入解凍液（預先在30℃的水浴鍋預熱），將解凍液稀釋好的精液置于30℃的水浴鍋10 min，從離心管中吸取4 μL在CASA全自動精子質量分析儀上進行檢測分析。

（2）豬冷凍精液解凍輸配技術操作方法。①準備好輸精瓶。②根據輸配量（母豬頭數）配置解凍稀釋液約40 mL/頭。③將配置好的解凍稀釋液放入30℃水浴鍋中預熱，約10 min。④待解凍稀釋液預熱好后，將豬冷凍精液取出放入50℃水浴鍋中解凍，15 s。⑤將解凍好的豬精液分裝入輸精瓶中，約8～10支細管/瓶，0.5 mL/細管。⑥將預熱好的解凍稀釋液分裝入輸精瓶中，約40 mL/瓶。⑦混勻后30℃孵育20 min后進行輸配。

3.3 溫控設備

凡是涉及到溫度參數的儀器設備，應定期進行檢定或校準，確認其已滿足溫度控制的使用要求。必要時可使用檢定合格的溫度計隨機監控。

4 精液離心

離心目的不僅是因為公豬精液量大而精子密度不高，需要縮小體積，有利于精液冷凍保存；而且可以除去精清，精清中存在危害精子的因素，影響精液冷凍和解凍效果。這在馬、豬、山羊、狗的精液研究中已被發現[30]。因此，離心已是精液冷凍過程中一項通用的技術要求。精液離心的關鍵技術要點是對離心轉速和離心時間的把握。轉速過高或離心時間過長對精子有傷害，Salamon（1973）研究豬精液發現，用1 000 r/min離心10 min，對冷凍后活率有不良影響[19]。為避免和減小離心可能造成對精細胞內物質的滲出，轉速與離心時間的選擇應以實際離心效果作為參考，筆者不建議離心后精子集中在離心管底部呈塊狀的效果，此現象一方面不利于精子的轉移，同時加大精子轉移撞擊損傷。對于離心時環境溫度的選擇，各家雖有不同，但必須注意到離心環境溫度與精液溫度的一致性。

5 精液凍前的降溫、平衡

平衡是指稀釋后的精液放置在低溫下經歷一定的時間。平衡這一步驟是Polge在研究公牛精液冷凍方法時最先提出的，平衡溫度在歐美國家通常為4～5℃[30]。平衡的機制至今尚不清楚，平衡通常是指甘油的作用。甘油平衡的必要性，是以冷凍方法和動物種類不同而異。豬精液冷凍降溫時間控制在2～3 h，平衡時間不少于1.5～2 h。目前的研究認為，甘油滲透到精子體內需要的平衡實際很快，甘油同精子接觸5 s至15 min，已能夠對精子產生足夠的保護作用[31]。Blackshaw認為，采用這一步驟還可能與細胞的離子平衡的變化有關，精子在稀釋后重建離子的平衡可能需要一定的時間[30]。有較多報道認為，延長5℃平衡時間明顯提高抗低溫打擊。

精液在達到平衡溫度的同時，還有一個逐步降溫（適應）過程。嚴格地說，是應將降溫和平衡的時間分開，不適合籠統叫平衡時間。目前采用一次稀釋法（含甘油）的，無法區分降溫和平衡的時間，只能統稱平衡時間或降溫平衡時間。二次稀釋法，先加無甘油的稀釋液，降溫至4～5℃再加含甘油的稀釋液作平衡，即可分清降溫和平衡的時間。

豬精液冷凍一般多采用二步稀釋法，對離心后精液先用不含甘油的預稀釋液稀釋，后待溫度慢慢降至平衡溫度條件下再加入含甘油的稀釋液[32]。因為，經過降溫、平衡，在精子已處于半休眠狀態時，緩緩加入含甘油稀釋液，這樣高滲的稀釋打擊，對精子的傷害相對要小一些[33]。在低溫平衡的條件下，輕輕擺動平衡的精液，同時，采用滴加的方式緩慢的添加甘油稀釋液，這樣操作似乎更符合上述理論的解釋，也許又是一項新的突破。

6 精液冷凍生產過程的質量控制

6.1 質量的不穩定性

活力在0.7級以上的豬原精液，過濾后采用3步稀釋法制成冷凍精液，解凍活力在0.3級以上[34]。胡建洪試驗，凍后精子活率達到0.513，精子頂體完整率達75.3%，質膜完整精子達51.3%[35]。在批量生產的情況下，活力達到80%以上[2]。上述類似報道較多，精液凍后結果不盡一致，質量差異明顯，并帶有一定的普遍性。由此可見，這樣的凍精質量水平就一個區域性來評價，完全是處于一種不穩定的狀態。豬冷凍精液作為一種特殊的生物產品，其質量影響因素諸多，質量極易出現波動，精液冷凍過程中任何一個關鍵技術環節上的失誤可導致全過程的失敗。這已引起相關技術人員的關注。為確保豬的精液凍后質量始終處于受控狀態，應不定期的對精液質量性狀進行評估和追溯分析，及時發現可能影響因素，及時采取相應改進與控制措施。

6.2 生產工藝的改進與規范

豬冷凍精液目前需要解決的是改良精液的冷凍和解凍等操作過程對精子細胞質膜和精子活力等造成的不利影響[1]。以目前現狀，為了保證冷凍精液產品質量的穩定與可控，不僅對于該產品生產流程的每一個環節、每一個步驟，均應嚴格執行標準作業程序。而且應該繼續對凍精生產工藝的各個環節進行優化組合[36]，其技術要點與質量控制將是今后實施標準化生產的重要基礎。需要盡快出臺具有較強的科學性和可操作性的豬冷凍精液技術規范標準，這將有利于該產品質量的提高和推廣。