蘋果扦插繁殖生根機理研究進展

杜學梅，楊廷楨，高敬東，王 騫，蔡華成，李春燕，王淑婷，弓桂花

（山西省農業科學院果樹研究所/果樹種質創制和利用山西省重點實驗室，太原030031）

0 引言

植物扦插繁殖是利用植物營養器官的再生能力發生新根或新芽而長成一個獨立的植株。扦插繁殖可保持母體的遺傳特性，變異較小，苗木生長一致，且繁殖方法簡便，取材方便，繁殖季節長，繁殖系數大。這些特點對實生變異較大、不能保持后代一致性的蘋果砧木意義重大。蘋果為扦插繁殖難生根樹種，蘋果矮砧更是極難生根，在不加激素的情況下不可能生根[1-2]。盡管如此，近年來在蘋果砧木扦插生根機理研究方面仍取得了一定進展。筆者從解剖結構、生理生化、分子生物學研究等方面對其研究進行綜述，以期為蘋果扦插繁殖機理的進一步研究提供參考，同時為促進蘋果扦插技術的深入發展提供理論支撐。

1 不定根發生的形態解剖學研究

對扦插不定根發生形態解剖學研究，目前主要集中在插穗的生根類型、莖的解剖結構和根原基類型3個方面。一般認為插穗的生根類型有皮部生根型（易生根類型）、愈傷組織生根型（難生根類型）、混合生根型（兼具皮部和愈傷組織2種生根類型）3種類型，混合生根類型較單一生根類型容易生根，多數植物屬混合生根類型[3-5]。從莖的解剖結構看，插穗不定根的發育可分為3個階段，第一階段為不定根誘導階段，解剖結構表現為細胞脫分化形成根原始體；第二階段為不定根形成階段，即根原始體分化成可見的根原基；第三階段為不定根表達階段，即根原基發育成不定根并突出莖外成裸眼可見的不定根[6-8]，多數研究表明，插穗皮層與韌皮部間沒有環狀的厚壁組織，或者雖然有但呈不連續狀，則生根相對容易[9-11]。也有人認為環狀厚壁組織可通過外源生長素刺激而打破，不會妨礙不定根的生長[12]。依據根原始體的形成時間，可將不定根原基分為潛伏根原基和誘導根原基2 種類型，有些果樹是在枝條生長期間未離開母株時，在莖組織內就已形成根原體，并多從形成層與髓射線交界處產生，即為潛伏根原基類型[13]，一般該類型的植物容易生根；大多數果樹是在扦插過程中，在外部刺激下莖內部部分細胞恢復分裂能力，進行細胞反分化形成根原體，產生不定根，為誘導根原基類型[13]，該類型的植物生根相對困難。

研究表明，海棠果插穗在扦插前的插穗切片中未發現有潛伏根原基的存在。扦插5天后莖內少數維管射線細胞向韌皮部方向加寬成多列，10天后形成一團細胞核大、排列緊密與周圍細胞有明顯區別的薄壁細胞團，這些恢復了分生能力的薄壁細胞團就是初期的根原基。海棠果插穗不定根組織學上的起源是維管形成層[14]。垂絲海棠插穗不定根組織學起源是愈傷組織的薄壁細胞分化而來。垂絲海棠扦插10 天后形成由一團薄壁細胞組成的愈傷組織，隨后這些愈傷組織內部的一些細胞開始分化成輸導組織，同時在愈傷組織中部形成自身的木質部和形成層，木質部外側的一些細胞特化成具有根原始體的細胞，這些細胞繼續分化形成根原基，根原基經過細胞分裂和伸長生長，在扦插38 天后最終突出愈傷組織成為不定根。垂絲海棠生根類型屬于愈傷組織誘導型[15]。‘SH40’蘋果矮砧插穗無潛伏根原基，其根原基在韌皮部、皮層部位及髓射線處均可形成[1]。紅纓海棠組培苗嫩莖誘導生根2天后，髓部細胞和部分維管形成層細胞開始旺盛活動，4 天后其內部部分細胞的體積、細胞核、核仁進一步增大，經多次分裂組成的細胞團，經多方向的細胞分裂形成根原基輪廓，到第8天已逐漸形成生長點和根冠，10天后可明顯見不定根。紅纓海棠不定根起源于莖維管形成層細胞，無潛伏根原基[16]。‘M9’試管無根苗在生長素誘導5 天后，維管形成層細胞開始旺盛分裂，到第7天時形成類似球形并向韌皮部凸起的根原基輪廓，不定根原基細胞陸續出現。其不定根起源于莖維管形成層細胞[17]。目前的研究表明，蘋果矮砧不存在潛伏根原始體，均為誘發根原始體類型，可在維管形成層（如海棠果）、韌皮薄壁組織細胞（如‘SH40’）等部位誘導出根原始體，也可經愈傷組織（如垂絲海棠）誘導形成根原始體。但蘋果砧木種類繁多，不同品種（株系）材料或同一品種不同單株之間在形態結構、生長發育規律及對外界環境條件的適應能力等方面都存在明顯差別[18]，因此，對其不定根生根類型、莖的解剖結構和根原基類型方面的研究結論，還有待于今后進一步豐富材料證實。

2 扦插生根的生理生化基礎

2.1 植物激素與生根

根原基的形成是一個受激素調控的復雜過程，生長素起關鍵的調節作用[19]。大量研究表明，生長素是促進不定根形成的主要激素，生產實踐中也發現，同一品種半木質化帶葉嫩枝扦插較硬枝扦插更容易生根，原因之一就是芽和葉產生的生長素向下運輸并積累在插枝基部，從而促進插枝生根。如果用2,3,5-三碘苯甲酸等一些能阻止生長素運輸的生長抑制劑處理插條，則插條基部的生長素含量減少，生根率下降[20]。對于一些難生根的樹種品種，當用生長素處理插條基部后，被處理部位的薄壁細胞便可恢復分裂的機能，形成根原基或產生愈傷組織，然后長出不定根，使扦插難以生根的樹種得以生根[21]。

常用的促進插枝生根的外源生長素有IBA、IAA、NAA 等，普遍認為IBA 由于穩定性好于IAA，生根作用也強于IAA 和NAA[22]。但也有例外，許曉崗[15]在進行垂絲海棠和楸子的扦插試驗時，認為IAA效果最顯著，強于IBA 和NAA。可見，植物生長素對生根的促進作用同生長素的種類、濃度及處理時間密切相關。史莉等[23]進行山荊子全光迷霧扦插育苗試驗時發現，用清水處理的山荊子生根率為24.4%，而用ABT1號生根粉（主要成分為IBA）浸蘸1 h 處理的生根率為45.8%。韓靜[24]的研究表明，對于易生根的圓葉海棠，無論硬枝還是嫩枝，生長素處理對生根效果沒有影響，而對難生根的‘MM106’、‘M26’、‘T337’，嫩枝扦插‘MM106’、‘M26’以 IBA 3500 mg/L 速蘸 10 s 生根效果最好，生根率達74%、32%，‘T337’則以NAA 2500 mg/L 速蘸10 s 生根效果最好（生根率8%）；硬枝扦插‘MM106’以ABT生根粉1號200 mg/L浸泡2 h生根率最高（為14%），‘M26’以NAA 1000 mg/L 蘸30 s生根效果最好，生根率10%，不同濃度激素處理對‘T337’硬枝扦插無影響，生根率均為0。肖祖飛等[25]研究表明，IBA能促進蘋果砧木插條生根，‘中砧1號’童期時的頂梢最適宜的IBA處理濃度為3000 mg/L速蘸插條基部1 min。李海偉等[26]用清水處理‘B9’嫩枝扦插生根率為51.7%，而經IBA 蘸30 s 處理后可達89.7%，生根率顯著提高，IBA 在500～1500 mg/L 的范圍內生根率隨IBA濃度增加而增加。張秀美等[27]研究表明，‘遼砧2號’綠枝扦插清水處理生根率僅為8.3%，經 IBA 1000 mg/L+NAA 100 mg/L 蘸 30 s 處理后生根率可達50%，生根效果好于IBA、NAA單獨處理。

一般認為，植物內源的生長素含量決定了植物扦插生根的難易程度。生長素通過調節插穗內部貯藏營養的分配，影響相關酶的生成和活性，進而影響根原基的形成和發育而影響生根。弦間洋[27]認為IBA可促進碳水化合物和還原糖在插條基部積累，促進淀粉水解，同時還可提高基部IAA水平，從而促進生根。Alvarez等[28]認為，‘M26’組培苗基部自由IAA含量是‘M9’的2.8 倍可能是‘M26’生根率高于‘M9’的原因。許曉崗[15]發現，楸子嫩枝插穗在扦插后第6天，垂絲海棠在第4 天，插穗內生長素含量升高，形成高峰，以后逐漸下降，到 11 天后趨于平緩；IAA 與 ABA 比值和 IAA 與IPA+ZR比值在第4～6天出現峰值，這和不定根原基的起始細胞建立時間相一致，證明早期大量生長素的產生是扦插所必需的，且用IAA與ABA比值大致可表示海棠果插穗的生根能力，比值大，生根率高。

除生長素外，植物內源激素赤霉素類(GA)、脫落酸(ABA)、細胞分裂素類（IPA、ZR、DHZR等）等均不同程度影響著插穗根原基的形成。ABA 被認為是抑制扦插生根的主要物質之一[15,29]，有研究表明‘紅玉’蘋果難生根就是由ABA的抑制作用造成的[30]。GA和細胞分裂素類物質被認為對多種植物不定根的產生有抑制作用[31]，但也有研究表明，細胞分裂素類物質與生長素共同作用促進細胞分裂，究竟何種比例對生根有利，何種比例抑制生根，還有待于進一步研究，但單獨使用對生根影響不大[15]。由此可見，插穗生根受多種內源激素影響，根原基的形成是其綜合作用下形成動態平衡的結果，對蘋果砧木等扦插難生根樹種，研究其生根過程中內源激素動平衡形成的機制，對促進插條生根意義重大。

2.2 酶的活性與生根

很多研究表明，一些種類的酶與不定根的發生有關。目前研究較多的，也是公認的同蘋果扦插生根能力密切相關的酶主要有過氧化物酶(POD)、吲哚乙酸酶(IAAO)和多酚氧化酶(PPO)。

過氧化物酶被視作植物扦插生根的標志之一，是一種活性較高的酶，參與生長素的代謝、呼吸、細胞壁的合成和傷害反應[32]，與不定根的誘導和生長密切相關。傷害或逆境反應時，先是堿性POD 被激活，通過調節生長素的代謝，誘導生根，隨后酸性POD激活，促進根發育過程中的木質化和細胞壁的合成[33]。宋金耀等[34]研究表明，易生根樹種（柳等）硬枝和嫩枝扦插時，插穗的POD活性均為前期降低，然后升高，而蘋果、梨等難生根樹種則表現為前期升高而后期降低，認為由于扦插后POD一直保證較高活性，沒有前期的活性回落是蘋果等樹種難于生根的主要原因。這同杜偉[35]在桑樹上硬枝扦插的研究結果一致，無論是在愈傷組織生根類型還是在皮部生根類型生根過程中，POD酶活性均表現先上升后下降，說明POD酶活性是離體生根的生化指標之一。

吲哚乙酸酶是植物體廣泛存在的一種酶，是一種含Fe 的血紅蛋白，具有降解IAA 的作用，在扦插繁殖過程中，IAAO通過調節插穗內IAA含量水平，直接影響其生長發育和其他生理活動，從而影響不定根的形成和生長[36]。宋金耀等[34]研究表明，硬枝扦插后，易生根樹種（柳）插條內IAAO 活性基本呈下降趨勢，難生根樹種（蘋果等）正好相反，其插條內IAAO 活性基本呈上升趨勢，分析認為IAAO 活性的降低使IAA 含量升高，對根的形成過程有促進作用。而IAAO 活性升高氧化或抑制了IAA，從而使蘋果等的不定根難以形成。

多酚氧化酶是一種含銅的酶，普遍存在于高等植物體內，具有催化酚類物質氧化的作用。其中一個重要的作用是能夠催化IAA 與酚類物質縮合形成IAA-酚酸復合物，是一種促進不定根形成的生根輔助因子[37]，對不定根的形成有重要作用。PPO 主要集中于插穗不定根的起源部位，影響細胞分裂分化及根原基的形成和生長[38]。有研究表明，垂絲海棠、楸子當年生枝扦插生根率同多酚氧化酶活性呈顯著負相關[14]。也有正好相反的結論，認為多酚氧化酶與不定根的形成呈正相關，其活性和含量在不定根形成初期升高，而當根形成后活性持續下降[39]。

2.3 枝條內水分及單寧等其他生理生化物質與生根

插穗內的含水量對扦插成活起決定性作用，枝條的含水量是影響扦插最大的因子[5,40]。許曉崗[15]研究發現，垂絲海棠和楸子不同類型插穗的含水量不同，徒長枝的分別為52.42%和44.02%，明顯高于結果枝和當年生枝(52.35%、51.77%，43.09%、43.11%)；自由水含量以當年生枝最高，徒長枝最低，束縛水含量與自由水含量正好相反。扦插后含水量的變化趨勢也不一致，當年生枝的總含水量和自由水含量隨扦插時間的延長逐漸下降，徒長枝為先上升后下降，而結果枝總含水量和自由水含量則表現為逐漸上升。插穗內總含水量和自由水含量越高，插穗越容易生根，插穗生根率與總含水量和自由水含量呈顯著正相關。

另外有研究表明，還有一些生化物質對蘋果扦插生根起著促進或抑制作用。Cuuriv 等[41]認為，黃酮類化合物是IAA 氧化酶的抑制劑，可提高內源IAA 含量，促進生根。日本學者[42]研究認為根皮酚作為IAAO和POD 的基礎物質，具有防止IAA 氧化的作用，從而促進‘M9’生根；間苯二酚也可增加‘M9’的生根率；對二羥基苯、咖啡堿、綠原酸、根皮苷、根皮苷分解產物根皮素和根皮酸可促進發根數的增加，而阿魏酸和繖形酮可抑制發根，使發根率降低，水楊酸則完全抑制發根，使發根率為0。許曉崗[14]研究發現單寧對插穗有毒害作用，對生根也有抑制作用，但不是影響扦插生根的主要因子。

2.4 枝條營養物質與生根

枝條中的營養物質是不定根形成的物質基礎，營養物質為插穗提供生根所需的基本物質和能量，是不定根產生的必要條件[17]。枝條貯藏的營養物質主要有葡萄糖、淀粉等碳水化合物，同時還有一定量的氨基酸和蛋白質等含氮化合物。不定根的孕育過程需要消耗大量的糖，有研究表明[43]，在蘋果莖尖外植體不定根發生的誘導期，形成層細胞中質體的比例主要為淀粉粒顯著增加，推測可能是這些淀粉粒通過水解作用轉化成的糖類物質供給不定根啟動期所需的能量。宋金耀等[44]研究發現，扦插后插穗中還原糖含量開始都明顯降低，一直到愈傷組織大量出現期間，易生根樹種插穗內還原糖含量一直保持較低水平，而難生根的蘋果等樹種則明顯升高，到不定根產生后，由于植株成活產生了光合作用，減緩了插穗內糖分的消耗，易生根樹種還原糖含量有所升高，而難生根樹種由于已接近死亡，還原糖含量也就不再降低。也有不同觀點，許曉崗[15]在研究垂絲海棠和楸子插條可溶性糖含量與扦插生根率的相關性時發現，雖然同一時期采集的插條當年生枝的可溶性糖含量明顯高于結果枝，其扦插生根率也明顯高于結果枝，但當年生枝可溶性糖含量與扦插生根率相關性不明顯（相關系數0.47、0.4），而結果枝則呈極顯著負相關；扦插生根過程中，垂絲海棠和楸子當年生枝可溶性蛋白含量隨著扦插時間的延長表現先上升后下降，其中垂絲海棠可溶性蛋白含量4月15日扦插的較3月23日扦插的提早近10天達到峰值，更有利于插穗切口愈合生根。而王麗[1]則認為，基部黃化處理可提高‘SH40’嫩枝扦插生根率是因為黃化處理可提高插穗體內淀粉含量，并轉化成可溶性糖含量增加有利于生根，與可溶性蛋白含量關系不大。

許多試驗證明，碳水化合物和含氮化合物對根原始體的分化有重要意義，C/N 值可作為生根難易的判斷指標，C/N值大生根能力強[5,45-47]。蘋果品種、砧木類型較多，品種、同一品種枝條類型、采穗時間、生根類型等不同，其生理代謝活動均不盡相同，營養物質對不定根的影響是與其他物質共同作用來進行的，對不定根影響機理機制還需驗證。

3 扦插生根的分子生物學研究現狀

隨著現代生物技術的快速發展為蘋果扦插生根的機理研究提供了重要的技術手段和方法，不定根形成發育研究已從簡單的組織解剖學逐漸深入到基因、蛋白水平，盡管蘋果扦插繁殖分子生物學研究起步較晚，但近年來也取得了一些進展。

許曉崗等[48]利用SDS-PAGE電泳技術和酶聯免疫吸附分析法，找到了與楸子生根相關的可溶性蛋白是分子量為83、72、65、52、43、39、31、28、26、22 ku的蛋白質，其中，分子量為65、39、26、22 ku 的蛋白是調控蛋白，根原基分化時存在，不定根形成后消失，52 ku的蛋白是阻礙細胞分裂的蛋白，對生根不利，其余蛋白均可促進楸子插穗生根。王麗[1]認為，ARRO-1、ARF7、ARF19是與生根相關的基因，而ARRO-1是參與‘SH40’嫩枝扦插不定根形成的主要基因。Welander 等[49]將rolB基因導入‘M26’后改善了其生根能力。楊利粉等[50]研究發現，絞縊處理可顯著提高蘋果矮化砧木‘9-3’壓條新梢的生根率和生根條數，且新梢生根時間也早于對照，進一步研究表明，絞縊新梢壓條生根期間，ARRO-1基因表達量呈先上升后下降趨勢，在不定根發生始期達到峰值，新梢愈傷組織形成期ARF7、ARF19表達量顯著高于絞縊處理，認為絞縊處理促進了生根過程中ARRO-1、ARF7、ARF19的表達，從而有利于根原基分化，最終提高了壓條新梢的生根率和根條數。王榮[51]利用轉錄組學技術研究了3種近緣性不同蘋果砧木插穗中不定根向重力性定點角(GSAS)形成的影響因素，表明不定根GSAS形成時期基因DFR、HCT1A和CYP78A5等下調，促進了柚皮素、槲皮素等類黃酮化合物和生物堿化合物的合成，不定根GSAS大的插穗中，E-2-己烯醛相對含量多，IAA/ZR 和IAA/GA3值大，為闡明蘋果砧木不定根向重力性角形成調控網絡提供了理論依據。田河[52]在‘M26’蘋果矮砧組培苗不定根誘導過程中，應用mRNA 差異顯示技術，利用8個上游隨機引物和3個下游錨定引物共擴增出41 條差異基因，包括誘導后上調表達基因2 個和下調表達基因1個及特異表達基因38個。初步建立了蘋果矮化砧木生根過程中的相關基因篩選體系。徐曉召[53]研究發現，在相同處理措施下，童期‘中砧1號’綠枝扦插生根率顯著高于成齡期，通過對其生根機制研究發現，miR156的高水平表達是‘中砧1號’綠枝插穗不定根發生的必要條件之一，但miR156影響生根不依賴調控AFR和PIN表達，而是通過MxSPL26調控RTCS基因表達，進而影響不定根的發生。miR156 轉錄因子SPL20、SPL21、SPL22、SPL26都參與了不定根的發生過程，SPL26起主要作用。‘中砧1號’童期綠枝插穗在IBA 處理后6～48 h 中，NAC29、MYC2、SBP5、ERF003、WRKY75、MADS轉錄因子基因和WRKY29、C3H67蛋白均顯著上調表達，啟動不定根發生。成齡期的‘中砧1號’綠枝插穗在IBA處理后6～48 h中，差異表達基因6390個，其中受IBA誘導下調表達的有2900個。IBA處理后HB13基因快速響應，隨后生長素運輸蛋白基因、誘導蛋白基因和響應蛋白基因以及細胞分裂分化相關基因均顯著下調表達，表明成齡蘋果砧木插穗不能形成不定根的原因主要是成齡期插穗主動響應并抵御IBA運輸，通過抑制細胞分裂、脫分化與再分化等生理過程，抑制了不定根的發生。

4 展望

扦插繁殖是獲得自根苗最經濟有效的技術手段（途徑）。扦插繁殖成功與否則取決于插穗不定根的發育。不定根的發生是一個受多因素影響的復雜的生物學過程，對不定根形成機理的研究早已深入到分子水平，有多個參與生長素代謝或信號轉導的基因被克隆，還有許多參與不定根形成的轉錄因子被鑒定。但對蘋果不定根形成的相關研究卻相對滯后，雖然蘋果扦插繁殖起步較早，但由于生根難、研究力量薄弱等原因，目前僅基本上明確了扦插繁殖過程中不定根發生、發育的形態解剖構造，對其生根過程中植物激素動態水平及激素的相互作用，以及相關酶活性及營養物質動態變化規律等方面的研究仍有分歧，還有待通過更多的例證加以證明。可喜的是目前在蘋果矮砧扦插繁殖機理研究方面已深入到分子水平，同扦插生根的相關基因篩選體系已初步建立，同生根相關的一些基因已被鑒定、克隆，個別矮砧扦插難以生根的分子機制已被探明，為解決蘋果矮砧扦插繁殖難的問題提供了理論技術支撐。

隨著分子遺傳技術的不斷完善與發展，今后應在分子水平上全面深入開展不定根形成機理研究，如激素調控不定根發育的分子機制的研究，不定根發育的生長素信號通路研究，轉錄因子調控不定根發生的分子機制研究，植物基因誘導表達調控研究，植物扦插生根生理調控等方面的研究，獲得更多與不定根發育的相關基因和蛋白，并分析其功能和作用機制，最終有效調控不定根的發生發育，使扦插難生根樹種品種變得容易生根，從而廣泛應用于生產實踐，推動相關產業的發展。