mu阿片受體活化促進胰島素樣生長因子Ⅰ致乳腺癌細胞增殖

劉 艷 吳 彤 汪曉強 陳雪梅 蘇殿三 俞衛鋒 田 婕

乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤,中國每年乳腺癌的新患病例數和死亡例數分別占全球的12.2%和9.6%[1]。乳腺癌患者常伴有血清胰島素樣生長因子Ⅰ(IGFⅠ)水平升高,且其水平與乳腺癌發病風險呈正相關[2-3]。IGFⅠ能夠促進細胞有絲分裂,抑制細胞凋亡,被認為是乳腺癌發生、發展關鍵的致病因素之一[2-4]。嗎啡、芬太尼等阿片類藥物在臨床上普遍被用于乳腺癌患者手術時鎮痛和術后慢性癌痛的治療,然而近年來,越來越多的臨床和實驗室研究結果提示,激活體內的阿片系統,可能會影響腫瘤的生長、侵襲和轉移。Nguyen等[5]研究發現,在乳腺癌小鼠模型中使用嗎啡,能夠刺激其腫瘤發展并影響生存率。對阿片系統與腫瘤的進一步研究發現,mu阿片受體(MOR)作為臨床常用阿片類藥物的主要結合靶點,在多種腫瘤的發生、發展中均具有不容忽視的作用[6-7]。Lennon等對非小細胞肺癌細胞系細胞轉染MOR過表達質粒后發現,細胞中MOR蛋白表達水平升高伴隨著腫瘤相關信號通路磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)的明顯激活,以及細胞增殖、轉移能力的顯著增強。對IGFⅠ致乳腺癌發生、發展的機制研究顯示,IGFⅠ與其受體(IGFⅠR)結合后,通過其受體底物磷酸化,激活PI3K/Akt信號通路,從而促進細胞增殖和腫瘤進展[8-9]。本研究旨在探討在乳腺癌的發展過程中,阿片系統與IGFⅠ系統之間的關系,以及MOR對IGFⅠ致乳腺癌發生、發展的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞培養 人乳腺癌細胞株MCF-7購自中國科學院上海細胞庫。采用含10%FBS、100 U/mL青霉素、鏈霉素的無酚紅DMEM完全培養液,于37℃、體積分數為0.05的CO2培養箱內培養,隔天換液,2～3 d傳代。

1.2 Western印跡法檢測MOR蛋白表達 在MCF-7細胞培養液的上清液中加入不同質量濃度(20、100、1 000μg/L)的IGFⅠ培養24 h。此外,以質量濃度為100μg/L的IGFⅠ刺激MCF-7細胞15、30 min和1、6、12、24 h。對照組均加入等量培養液,每組設3個復孔。細胞生長至亞融合狀態時,收集細胞,以細胞裂解液冰浴裂解30 min。蛋白定量按二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(美國Pierce公司)說明書方法操作。以總蛋白量20μg/孔按Bio-Rad試劑盒說明書進行10%SDS-PAGE變性電泳。電泳完畢,將凝膠上的蛋白轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。Western印跡法所用一抗為兔抗人MOR多克隆抗體(1∶1 000,英國Abcam公司),二抗采用HRP標記山羊抗兔IgG(1∶2 000,上海碧云天生物技術有限公司),以化學發光試劑盒顯色。內參采用GAPDH。應用Image labTM軟件分析蛋白條帶灰度值,MOR蛋白表達水平以對照組的MOR與GAPDH的比值作為1,其他各組的值以與對照組的比值表示。

1.3 細胞周期檢測 取對數生長期MCF-7細胞在無血清培養液中培養24 h作同步化處理后,分別單獨或聯合加入100μg/L IGFⅠ、10μmol/L DAMGO(選擇性MOR激動劑),對照組加入等量培養液。每組設3個復孔。繼續培養24 h后,用0.25%胰蛋白酶消化細胞,用預冷的PBS洗2次,逐滴加入70%冰乙醇,于-20℃固定過夜,100×g離心5 min后,加入碘化丙啶染色液,室溫避光孵育30 min。流式細胞儀檢測細胞周期,應用Modfit LT 5.0軟件進行分析,處于增殖期的細胞數量以對照組S期細胞占細胞總數的百分比作為1,其他各組的值以與對照組的比值表示。

1.4 細胞活力檢測 以0.25%胰蛋白酶消化對數生長期單層培養細胞,用含10%FBS的DMEM培養液配成單細胞懸液,調整細胞密度為1×105/mL,以100μL/孔接種于96孔培養板。接種18 h換無血清培養液饑餓過夜后,分別單獨或聯合加入用無血清培養液稀釋的100μg/L IGFⅠ、10μmol/L DAMGO和1μmol/L甲基納曲酮(MNTX,MOR特異性拮抗劑),對照組加入等量培養液。每組設6個復孔。在37℃、體積分數為0.05的CO2條件下培養24 h后,每孔加入10μL細胞計數試劑盒8(CCK-8)溶液,繼續孵育1 h后,應用酶標儀檢測450 nm波長處各孔的吸光度(A)值,以對照組的A值作為1,其他各組的值以與對照組的比值表示。

1.5 Western印跡法檢測磷酸化Akt(p-Akt)表達在MCF-7細胞培養液的上清液中單獨或聯合加入用無血清培養液稀釋的100μg/L IGFⅠ、10μmol/L DAMGO和1μmol/L MNTX,對照組加入等量培養液,在37℃、體積分數為0.05的CO2條件下培養24 h。每組設3個復孔。Western印跡法的操作方法同前,將一抗改為兔抗人Akt和p-Akt多克隆抗體(1∶1 000,美國Cell signaling technology公司)。p-Akt的相對表達量以p-Akt與總Akt的灰度值比值表示。

1.6 統計學處理 應用SPSS 24.0統計學軟件。對于連續性計量資料,首先采用Kolmogorov-Smirnov正態性檢驗分析其是否符合正態分布,符合正態分布的計量資料以±s表示,兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。所有檢驗均為雙側檢驗,以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 IGFⅠ誘導MCF-7細胞中MOR蛋白高表達Western印跡法結果顯示,以20、100、1 000μg/L不同質量濃度IGFⅠ刺激24 h,MCF-7細胞中MOR蛋白的相對表達水平分別為1.32±0.04、1.54±0.10和1.10±0.06,IGFⅠ為20和100μg/L時MOR蛋白的相對表達水平均顯著高于對照組(P值均＜0.01),在IGFⅠ質量濃度為100μg/L時作用最顯著,見圖1。以100μg/L IGFⅠ刺激MCF-7細胞15和30 min,以及1、6、12和24 h時 MOR蛋白的表達水平分別為1.38±0.21、1.39±0.14、1.69±0.12、1.80±0.14、1.64±0.14和1.75±0.22,刺激15 min時MOR蛋白即開始升高,刺激30 min和1、6、12、24 h時均顯著高于對照組(P值分別＜0.05、0.01),在刺激6 h時作用達到高峰,見圖2。

圖1 Western印跡法檢測不同質量濃度IGFⅠ刺激24 h后MCF-7細胞中MOR蛋白的表達

圖2 Western印跡法檢測100μg/L IGFⅠ刺激不同時間后MCF-7細胞中MOR蛋白的表達

2.2 活化MOR促進IGFⅠ致乳腺癌細胞增殖的作用 流式細胞術檢測細胞周期的結果顯示,采用100μg/L IGFⅠ刺激MCF-7細胞24 h后,處于增殖期的細胞數量為5.39±0.19,顯著多于對照組(P＜0.01);而采用10μmol/L DAMGO預處理2 h后再與IGFⅠ共同刺激24 h,處于增殖期的細胞數量進一步增多至6.20±0.01,顯著高于對照組和IGFⅠ單獨刺激組(P值均＜0.01);而DAMGO單獨刺激組處于增殖期的細胞數量為0.97±0.07,與對照組相比差異無統計學意義(P＞0.05)。

CCK-8檢測細胞活力的結果顯示,采用100μg/L IGFⅠ刺激MCF-7細胞24 h后,細胞活力為1.33±0.03,顯著高于對照組(P＜0.01);而10μmol/L DAMGO預處理2h后再聯合IGFⅠ共同刺激,細胞活力進一步增高至1.45±0.04,顯著高于對照組和IGFⅠ單獨刺激組(P值分別＜0.01、0.05);而DAMGO單獨刺激組的細胞活力為0.97±0.02,與對照組相比差異無統計學意義(P＞0.05),以上結果與細胞周期的檢測結果一致。此外,MCF-7細胞單獨用1μmol/L MNTX預處理2 h,細胞活力為0.96±0.02,與對照組相比差異無統計學意義(P＞0.05);MNTX預處理2 h后再與IGFⅠ共同刺激,細胞活力為1.40±0.06,與IGFⅠ單獨刺激組相比差異無統計學意義(P＞0.05);但在DAMGO與MNTX同時預處理2 h后再給予IGFⅠ,IGFⅠ與DAMGO聯合誘導的MCF-7細胞增殖被明顯抑制,此時細胞活力為1.21±0.05,顯著低于IGFⅠ與DAMGO聯合刺激組(P＜0.01)。

2.3 活化MOR提高了IGFⅠ誘導的Akt激活Western印跡法檢測結果顯示,采用100μg/L IGFⅠ刺激MCF-7細胞24 h后,p-Akt的相對表達水平為0.22±0.02,顯著高于對照組的0(P＜0.01);10μmol/LDAMGO預處理2 h后再給予100μg/L IGFⅠ刺激24 h,p-Akt的相對表達水平進一步升高至0.44±0.07,顯著高于IGFⅠ單獨刺激組(P＜0.01)。MCF-7細胞單獨用DAMGO或MNTX預處理2 h,p-Akt的相對表達水平均為0,與對照組相比差異均無統計學意義(P值均＞0.05)。DAMGO和MNTX同時預處理2 h后再給予IGFⅠ,其p-Akt的相對表達水平被明顯抑制至0.28±0.01,顯著低于IGFⅠ與DAMGO聯合刺激組(P＜0.05)。見圖3。

圖3 Western印跡法檢測IGFⅠ、DAMGO、MNTX單獨或聯合刺激后MCF-7細胞中p-Akt的表達

3 討 論

國際癌癥研究機構(IARC)公布的2012年全球腫瘤流行病統計數據顯示,乳腺癌的新發病例數占所有女性腫瘤新發布例數的1/4,死亡人數超過5萬。中國原屬于乳腺癌低發國家,但自20世紀90年代以來,隨著我國城鎮化的進程,其發病率呈快速上升趨勢,如今乳腺癌已成為中國女性發病率最高的腫瘤,居癌癥相關死亡原因的第6位[1]。

乳腺癌是一種全身性疾病,目前認為與其發病相關的因素包括月經初潮早絕經晚、遺傳因素、不健康的飲食和生活方式、激素和藥物的使用等,但其具體發病機制仍不清楚。近年來,胰島素樣生長因子系統(IGFs)在腫瘤發生、發展過程中的作用逐漸受到關注,其中IGFⅠ具有較強的促有絲分裂原性和抗凋亡活性,IGFⅠ在組織中的生物活性與其在循環血清中的水平呈正相關。國內外研究[2-3,10]顯示,乳腺癌患者血清中IGFⅠ水平明顯高于乳腺正常和良性疾病患者。動物實驗為IGFⅠ致乳腺癌的作用機制研究提供了更直接的證據。本課題組的前期研究[11]發現,與野生型姐妹小鼠相比,IGFⅠ轉基因(Tg)小鼠的自發乳腺癌、低劑量或高劑量致癌劑二甲基苯蒽(DMBA)致乳腺癌發病率均明顯較高,且發病潛伏期顯著縮短。對IGFⅠ致病機制的研究[8]提示,IGFⅠ主要通過與其受體(IGFⅠR)結合,導致受體底物如胰島素受體底物1(IRS-1)酪氨酸磷酸化,進而激活PI3K/Akt/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路,引起細胞周期蛋白D1(cyclin D1)在細胞核中聚集,從而促進細胞增殖和腫瘤發生侵襲、轉移。

乳腺癌是一種具有高度異質性的腫瘤,其預后除了與分子表型、腫瘤組織學分級等疾病本身的因素有關外,與手術、放射和化學治療等處理因素也密切相關。手術是乳腺癌患者重要的治療方式,其各個環節都可能影響腫瘤的局部復發和遠處轉移。阿片類藥物是臨床上最主要的麻醉和鎮痛藥物之一,其對腫瘤患者手術后遠期復發和轉移的影響一直是近年來研究的熱點。Gupta等[12]通過在體和離體實驗均發現,臨床常用劑量的嗎啡可以通過與G蛋白耦聯受體(GPCR)結合,激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/細胞外調節蛋白激酶(ERK)和PI3K/Akt信號通路,從而促進人血管內皮細胞增殖和新生血管形成,最終加速乳腺癌進展。而Janku等[13]通過一項隨機安慰劑對照試驗也發現,使用MOR特異性拮抗劑MNTX可以提高晚期癌癥患者的總體生存率。此外多項研究結果提示,阿片類藥物可以不同程度地抑制機體抗腫瘤免疫系統的功能。一項臨床研究[14]結果顯示,七氟烷麻醉聯合術后芬太尼鎮痛能顯著抑制乳腺癌患者術后外周血中自然殺傷細胞(NK細胞)的活性。這些實驗室和臨床研究結果均提示,MOR作為阿片類藥物的主要結合靶點,可能參與了乳腺癌的發生、發展。

本研究探討MOR在IGFⅠ介導的乳腺癌發病中的作用機制,發現將IGFⅠ加入培養液上清液中刺激人乳腺癌細胞系MCF-7能夠上調其MOR蛋白表達水平。由此推測,IGFⅠ誘導MOR表達上調可能參與其致乳腺癌進展的機制機制,CCK-8法檢測細胞增殖/凋亡和流式細胞術檢測細胞周期的實驗結果均證實了該推測。外源性MOR激動劑DAMGO能進一步上調IGFⅠ對MCF-7細胞增殖的促進作用,而MOR特異性拮抗劑MNTX能夠逆轉DAMGO的作用,使細胞增殖水平回落。這一作用可能通過進一步提高Akt信號通路的激活水平介導。值得注意的是,在無IGFⅠ刺激的情況下,單獨激活或阻斷MOR對細胞增殖并無影響。細胞增殖與腫瘤的發生、發展密切相關,持續的細胞增殖被認為是腫瘤細胞的基本特征之一,也是腫瘤發生的重要機制,細胞增殖能力的增強能促進腫瘤的生長和轉移。臨床患者中,腫瘤細胞增殖能力較強往往預示著腫瘤預后不良。因此本研究結果提示,MOR可能與IGFⅠ相互作用,共同促進乳腺癌細胞增殖,從而影響患者術后的轉歸。

綜上所述,本研究發現IGFⅠ能上調乳腺癌細胞中MOR的表達,高表達的MOR在外源性激動劑的刺激下,可能通過提高Akt信號通路在IGFⅠ作用下的激活水平,參與IGFⅠ致乳腺癌細胞惡性增殖的作用,且該作用可以被MOR特異性拮抗劑阻斷。今后有待進行更深入的研究,進一步揭示阿片系統在IGFⅠ相關性乳腺癌發生、發展中的作用,為臨床上這類乳腺癌的防治提供新思路和靶點,也為該類患者手術時制定合理的麻醉與鎮痛方案提供有價值的參考。