黃曲霉毒素B1在乳畜中的轉化

■吳坤坦 齊德生

(華中農業大學動物營養與飼料科學系，湖北武漢430070）

黃曲霉毒素主要是黃曲霉和寄生曲霉產生的一類高致癌致畸性的次級代謝產物，包括黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2。其中黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）毒性和致癌性極強，其次是黃曲霉毒素M1（Aflatoxin M1，AFM1）。哺乳動物攝入的AFB1主要在肝臟由多種細胞色素氧化酶如CYP1A2作用形AFBO后發生進一步代謝，或者羥化其末端呋喃上C-10生成AFM1并進入乳汁中。AFB1在乳腺組織和瘤胃中也可代謝產生AFM1，因此減少AFM1向乳汁的轉移，保障奶產品的食品安全越來越受到人們的關注。

1 AFB1在肝臟的代謝

1.1 AFB1在肝臟中的代謝過程

AFB1因其在未被代謝活化之前不具有致癌性而被稱為前致癌物，經過代謝激活后形成環氧化物才具有致癌性(蒿艷蓉等，2009)。

動物主要是在腸道吸收AFB1，而肝臟對AFB1進行代謝轉化，攝入后約有50%～60%的AFB1在十二指腸被吸收，未被吸收的AFB1通過糞便排出體外。AFB1進入機體后經體內多種P450家族(如CYP1A2、CYP3A4、CYP2A6等)代謝轉化為多種代謝產物(齊琪，2012)。CYP1A2作為肝臟中公認代謝AFB1的優勢酶，可將AFB1氧化為AFM1、AFQ1和AFB1-endo-8，9-環氧化物，而CYP3A4氧化AFB1為AFQ1和AFBO，其中AFM1、AFP1、AFB1-endo-8，9-環氧化物可直接經尿液排出體外(蒿艷蓉等，2009)。但近年來有報道發現，CYP2A13也可以高效代謝活化AFB1，但CYP2A13在人呼吸道器官中特異性高表達，而CYP1A2幾乎不在該組織中發揮作用，因此CYP2A13可能與呼吸組織代謝AFB1有關(陸慧媛，2012)。AFM1在動物體內生成后，部分可與葡萄糖醛酸結合經膽汁進入小腸并經糞便排出體外(Stubblefield等，1983)，由于羥基可使其水溶性提高，因此AFM1可通過尿液、膽汁和乳汁迅速排泄(Egmond，1983)。一部分AFBO可與谷胱甘肽（Glutathione，GSH）在機體Ⅱ相轉移酶如谷胱甘肽轉移酶（GSTs）作用下結合，形成AFB1-硫醇尿酸（AFB1-mercaptutic acid，AFB1-NAC）并經尿排出體外(Swenson等，1977)；另一部分AFBO與DNA結合形成AFB1-N7-鳥嘌呤加合物(aflatoxin-N7-guanine，AFB1-N7-GUA)。通過DNA修復過程可快速將大部分AFB1-N7-GUA加合物清除后通過尿液排出體外(蒿艷蓉等，2009)；還有一部分與血清白蛋白結合后主要以AFB1-賴氨酸復合物的形式殘留于血液中；此外，還有約五分之一的AFBO開環后毒性降低，以AFB1-甲酰氨基嘧啶復合物經尿液排出體外。其轉化過程可歸納如圖1所示。

圖1 AFB1在體內轉化的過程

1.2 AFB1在體內的轉運

AFB1攝入后主要在肝腎處積累且肝臟中的毒素濃度低于腎臟。Shreeve等(1979)試驗發現AFM1都出現在牛的腎臟，且腎臟中AFM1的濃度顯著高于肝臟，說明AFM1主要殘留于腎臟中。Stubblefield等給奶牛口服黃曲霉毒素后，幾乎在牛的所有組織樣本中都發現了兩種黃曲霉毒素；肝臟中AFB1濃度比AFM1高，而腎臟AFB1水平比AFM1低，說明不同組織內主要殘留的毒素不相同。

AFB1的主要排泄途徑是糞便。有報道指出糞便排泄出含量最高的黃曲霉毒素是AFB1，同時也檢出了AFM1(Allcroft等，1968)。有學者給泌乳山羊口服放射元素標記的AFB1后檢出約為攝入量50%的AFB1(黃帥等，2015)。純品AFB1向乳中轉化效率高于飼料AFB1，且添加高劑量AFB1組轉化效率低于低劑量組，這可能是高濃度毒素還未完全吸收便排出體外的緣由(姜雅慧等，2010)。

2 飼料中的AFB1轉化為乳中AFM1的過程

在肝臟中AFB1末端呋喃上C-10被羥化生成AFM1后約數小時便可排泄到乳中，而經過幾天便可完全清除。AFM1也可由曲霉菌直接產生，但比例較低(王蕾，2008)。研究表明AFM1轉移至乳中的比例約為攝入AFB1為0.1%～6%，高產奶牛可高達6.2%(Coffey等，2009)。Britzi等(2013)建立了AFM1轉化率與產奶量之間的回歸方程：轉化率=0.515 4e0.0521×產奶量(R2=0.622 4)，不同泌乳階段之間AFM1的轉化率也存在著巨大差異，結果反映AFM1的轉化率隨著產奶量的增加而提高。相關性統計說明原奶中AFM1與飼料中AFG1和AFG2之間無明顯相關性而與飼料中AFB1之間存在正相關關系(徐華坤，2013)。

有許多外界和動物的因素變化會影響到AFM1進入乳中的含量，如AFB1攝入量、物種差異、乳腺細胞健康情況、飼料中青貯料的比例等(黃帥等，2015)，泌乳階段的不同也能導致AFM1的轉化率出現較大差異，兩者呈現正相關關系。產奶量是影響AFM1轉化效率的主要因素而體細胞數與AFM1的轉化率并不相關(Masoero等，2007)。實際生產情況可能更為復雜，因為隨著奶牛個體和健康的差異和生產水平的不同，奶牛和AFB1接觸時間的不同，轉化率可能會差異很大，大多數試驗表明AFM1在乳汁中的轉移率平均值為1.7%(Coffey等，2009)。由此看來，奶牛日糧中AFB1濃度即使低于20 μg/kg，也有可能導致牛奶中AFM1殘留超過0.4 μg/kg，因此可以推測，假設日糧中攝入AFB1水平基本不變，牛奶中AFM1殘留卻有可能在某一時期超標。如果按照1.7%的轉化率計算，那么當日糧AFB1含量大于30 μg/kg時，牛奶中AFM1的含量就會超過0.5 μg/kg；當日糧中AFB1含量大于3 μg/kg時，牛奶中AFM1的含量就會超過0.05 μg/kg(紀少麗等，2012)，并且當牛奶濃縮加工后情況變得更為嚴重。

AFM1主要是通過尿液排泄的，AFB1也可經此途徑排出體外。Galtier（2010）研究AFB1經消化吸收和肝膽循環后平均約2%出現在尿液中，而Helferich等（1986）研究發現口服放射元素標記的AFB1后，尿液檢測到放射性物質總量占攝入量不足三分之一，這說明AFB1不是通過尿液排出體外。Fernandez等（2015）讓24頭在泌乳期的山羊每日采食含2.5 mg/(kg·d)黃曲霉毒素的日糧三周后檢測尿液，發現尿液中含量最高的黃曲霉毒素是AFM1。

3 AFB1對乳腺上皮細胞的影響

乳畜攝入的AFB1在體內被轉化為AFM1并隨著乳汁排出，這一過程通常被認為是排毒過程，因為AFM1的毒性大約只是AFB1的10%，但AFM1進入乳制品后持續危害著人類的健康(陳丹，2016)。乳腺上皮細胞間形成的緊密連接（又稱為血乳屏障）是阻止某些物質由血液進入乳腺組織的天然屏障，具有不可滲透的特性。同某些治療藥物一樣，霉菌毒素需要特定的轉運蛋白進行轉運，并且轉運效率受到血液pH值變化影響很大。正常機體內血液pH值高于牛奶pH值，但有些疾病（主要是乳房炎）或者藥物會導致兩者pH值接近甚至顛倒，造成轉運效率提高，AFB1轉化率高于平常(施瓊等，2012)。BME-UV1具有乳腺上皮細胞的功能和生化標志物，并能夠合成α-乳清蛋白和α-酪蛋白，因此常作為牛乳腺上皮代謝模型來研究AFB1的代謝和細胞毒性，在BME-UV1細胞中添加2～16 μmol/l AFB1培養24 h后細胞活力便出現差異性(Caruso等，2009)；而Caruso等(2008)用2～8 μmol/l處理后，檢測出AFM1的轉化率約為0.01%～0.1%；Kamataki等(1992)與Kitamura等(1992)也用MCF-7細胞檢測AFB1的細胞毒性。

環境中的有毒物質可能也是某種轉運蛋白的配體。有的物質自身便可以增加轉運蛋白的表達，有的則是在其它物質的干預下提高轉運效率。ABCG2基因在奶牛、小鼠和人的乳腺組織中均有表達(Jonker等，2005)，其蛋白在藥物與毒素轉運中起到重要作用。在乳腺組織中，AFB1是在ABCG2蛋白協助下轉運到乳汁中(Van Hawarden等，2006)，使其在乳汁中的濃度被大大提高，AFM1作為AFB1的代謝產物也有可能是由轉運蛋白ABCG2蛋白轉運的(Sarkadi等，2004)。陳丹(2016)對ABCG2基因進行過表達后，乳腺細胞中AFM1的含量顯著升高；而基因抑制后毒素含量下降，說明AFM1在乳腺細胞的轉運中ABCG2基因發揮了重要作用。二噁英類物質（如PCB-126）污染牧草并被乳畜長期攝入可增強ABCG2蛋白向牛奶中的轉運外源性物質的潛力，導致AFM1在乳制品中含量大幅增加(Manzini等，2017)。STAT5A基因在乳腺上皮細胞的生長和增殖中起著非常重要的作用，并影響上皮細胞的間隙連接，AFB1處理細胞可能誘導了DNA損傷，引起STAT5A基因表達下調了約80%(Forouharmehr等，2013)。因此，通過研究AFB1對乳腺細胞的影響和機理，進而探索降低AFM1進入乳汁的措施和影響轉化的因素，為降低有害物質污染奶及奶制品的水平，保障乳制品安全提供基礎數據和理論依據。未來可應用在研究其它毒物與藥物穿越血乳屏障的機制機理。

4 AFB1在瘤胃中的代謝

4.1 AFB1在瘤胃中的代謝研究

有許多學者研究了AFB1在瘤胃中的代謝。有學者發現黃曲霉毒素在山羊中的代謝率比閹牛高兩倍以上(Upadhaya等，2009)，瘤胃壁可以快速吸收AFB1在肝臟代謝，直到120 min后AFB1才主要由腸道吸收(Moschini等，2010)。還有學者注意到瘤胃微生物與黃曲霉毒素之間的相互作用。Fedele等（2010）報道了在體外發酵瘤胃液中添加1 mg/kg的AFB1僅1 h后代謝率達到90%并檢測到AFM1；Auerbach等（1998）用14C標記AFB1后在瘤胃內容物中只發現了黃曲霉毒素醇的產生，認為檢測到的AFM1是肝臟產生后通過瘤胃-肝臟通路循環返回至瘤胃中的。也有報道發現AFB1在瘤胃中沒有發生明顯降解(Westlake等，1989)。有學者研究體外靜態培養的瘤胃微生物對毒素的代謝，在培養物中添加不同濃度的AFB1后降低了氨態氮濃度和甲烷產量，同時總揮發性脂肪酸和乙酸、丙酸等產量也逐漸下降（P＜0.05），并抑制了纖維素酶活(姜雅慧等，2010)，這可能是AFB1擾亂了瘤胃微生物的繁殖和功能的緣故。試驗發現揮發性脂肪酸在10 μg/ml毒素時濃度較低，推測在該水平下與纖維分解相關的微生物的活性受到抑制(齊琪，2012)。

4.2 降解AFB1的微生物

目前已報道的去除黃曲霉毒素的菌株基本上是通過菌體細胞壁的吸附作用來發揮作用，而目前得到的、降解AFB1的微生物在體外的最佳條件下降解效果較好，但缺乏進一步的動物試驗驗證。雷元培等（2011）分離出的枯草芽孢桿菌，能夠產生降解AFB1和AFM1胞外酶，其菌體培養物對AFB1和AFM1的分解率可達到81%和63%，且此細菌抗逆性及抗菌性均較好。李超波等（2012）報道了一株施氏假單胞菌能夠降解黃曲霉毒素B1，但降解效率較低，72 h后分解率才能達到82.91%。Farzaneh等（2012）報道的菌株UTBSP1能在24 h內降解85.66%的AFB1。張志敏等（2014）從秦川牛瘤胃中分離到芽孢桿菌WZ-2，在體外發酵培養72 h可使AFB1分解率達到79%，他同時還指出長期接觸霉菌毒素的反芻動物瘤胃內容物中可能存在能降解霉菌毒素的細菌。崔玉琦（2014）從非洲象糞便中分離的芽孢桿菌E-1-1-1產生的胞外酶的五個組分蛋白對AFM1有不同程度的降解，而組合后最優條件下分解率達到了94.3%，可能降解黃曲霉毒素的活性蛋白是一種復合蛋白的緣故。

4.3 微生物降解AFB1研究現狀

黃曲霉毒素的脫毒按類型可分為物理脫毒法、化學脫毒法和生物脫毒法，生物脫毒法又分為吸附脫毒和降解脫毒兩方面。吸附脫毒由于吸附過程是可逆的，外界變化后可能將吸附的毒素重新釋放出來，造成使用時效果不穩定；而降解脫毒直接將毒素降解為低毒或無毒物質更加安全徹底。直接將微生物用于降解黃曲霉毒素的報道不多，目前較為有效的辦法是利用微生物的胞外代謝產物來分解黃曲霉毒素(崔玉琦，2014)，李超波等（2012）指出，雖然真菌能夠降解黃曲霉毒素，但消耗時間長且不完全，因而影響實際應用。國內報道關于AFB1降解菌主要有嗜麥芽窄食單胞菌、施假單胞菌、枯草芽孢桿菌、乳酸菌和醋酸菌等，其中酵母和乳酸菌這些微生物主要是通過細胞壁吸附毒素(朱新貴等，2001)。有許多研究發現能降解黃曲霉毒素的微生物有細菌，霉菌，酵母菌等，但考慮到代謝副產物如色素以及菌株生長條件差異大，其實際使用效果有待提高。例如有學者在40頭生長育肥牛日糧中添加AFB1分解酶，僅有平均日增重提高11%(崔捷，2013)，并且缺乏相關代謝酶添加劑應用飼料中降解黃曲霉毒素的報道。因此今后利用分子生物學、基因拼接技術和DNA重組技術等手段，對解毒酶提取液進行分離純化獲得單一活性蛋白，同時克隆有效成分蛋白基因并在載體中進行高效表達，這是飼料安全新的研究趨勢(計成等，2010)。

5 牛奶中AFM1的控制措施

奶牛攝入AFB1及其代謝產物后不僅危害健康進而引起代謝疾病，還會降低生產性能和免疫力，最后進入牛奶中威脅乳制品的食品安全。我國《GB 13078—2017》中對飼料中AFB1的標準是不高于20 μg/kg，而《GB 2761—2017》規定乳和乳制品中AFM1的不高于0.5 μg/kg；FDA和歐盟《EU NO.165/2010》中要求中AFM1的含量不高于0.05 μg/kg，而對嬰幼兒的奶粉不高于0.025 μg/kg。因此采取有效措施控制牛奶中AFM1十分重要。根據控制階段的不同可劃分為預防黃曲霉毒素的產生、脫去飼料中的毒素或者去除毒素的毒性和消除牛奶中的AFM1等幾個環節。

5.1 預防黃曲霉毒素的產生

重視飼料原料質量和安全，減少日糧中攝入黃曲霉毒素水平是控制牛奶中AFM1最為經濟有效的措施。可通過培育抗曲霉菌的作物、科學計劃安排種植與收獲和適當運輸與倉儲措施來降低飼料中霉菌毒素的水平，從源頭控制牛奶中的毒素水平(Bryden,2001)。通過對原料控制可以有效減少奶牛對黃曲霉毒素的攝入，但這些還不足以保障乳制品的食品安全，因此需要采取其他措施來進一步減少AFM1的殘留風險。

5.2 物理、化學與生物解毒法

對于已經存在于飼料中黃曲霉毒素可采用多種方法脫去或者降低毒性，有物理解毒法、化學解毒法和生物解毒法。物理解毒法包括高溫失活、射線處理以及微生物細胞壁脫毒法等；化學解毒法是通過酸堿溶液等化學物質進行處理，但是存在飼料營養物質損失較大、污染環境和成本高等問題。生物脫毒法是通過添加微生物或者相關酶對毒素進行降解，有許多學者在體外分離到降解效果較好的枯草芽孢桿菌等，但缺乏進一步體內試驗驗證，并且存在成本和使用效果不佳等問題。目前使用較廣的解毒方法是礦物質吸附法，它的原理是利用膨潤土、硅鋁酸鹽及活性炭等吸附性強的物質吸附霉菌毒素，從而顯著降低霉菌毒素被機體吸收代謝的濃度(施瓊等，2012)。

5.3 消除牛奶中的AFM1

研究發現，經過4周的存儲，pH值為4.6的酸奶中AFM1并沒有顯著減少;然而pH值為4.0的酸奶經過4周存儲后，2種污染濃度酸奶中的AFM1均發生了明顯減少。因此，低pH值可能會降低AFM1的含量(Govaris等，2002)。有研究發現，高溫處理能夠清除32%以上的AFM1(Purchase，1967)，使用酸奶中不同菌株的乳酸菌可以降低AFM1水平(Elsanhoty等，2014)。

6 小結

目前我國對于奶制品的安全采取了一些措施，但嬰幼兒奶粉食品安全事件仍然時有發生，這反映了目前針對乳制品的安全控制措施仍不完善，因此牛奶中的安全問題持續受到人們的廣泛關注。AFM1殘留超標作為目前危害乳制品安全的主要問題，控制其污染水平，確保國民健康安全已經迫在眉睫。解決這些問題首先應以預防為主，給乳畜飼喂優質的日糧，從源頭上減少黃曲霉毒素的攝入；其次輔以一些解毒劑和脫毒劑，減少黃曲霉毒素的吸收和代謝；還可以在瘤胃和消化道定植有益的微生物降解毒素，并且研究黃曲霉毒素對乳腺上皮細胞的影響和機理，對減少毒素穿越血乳屏障以及增加動物對毒素的代謝率，維持乳畜健康都有著重要意義。