低聚異麥芽糖和棉籽糖對乳酸桿菌增殖及產酸效果的研究

■ 呂宏偉 畢夢凡 谷雪玲 肖克權 宋澤和 賀 喜 范志勇*

（1.湖南省畜禽安全生產協同創新中心，湖南長沙410128；2.湖南農業大學動物科學技術學院，湖南長沙410128）

腸道微生態是腸道內微生物與宿主形成的一個微生物系統，以乳酸桿菌為主的有益菌和以大腸桿菌、沙門氏菌為主的有害菌構成的微生態平衡是維持動物體健康的重要因素。為了提高畜禽的生產性能，改善腸道健康，提高腸道內有益菌的數量變得尤為重要。IMO和RFO作為益生元能夠明顯促進乳酸桿菌等有益菌的增殖，且不被有害菌沙門氏菌或大腸桿菌所利用[1]，從而達到改善動物腸道功能的作用。這在武書庚等[2]和劉佰陽等[3]的研究中都被證實，而目前的研究中鮮有報道IMO與RFO之間的作用效果的比較，特別是對乳酸桿菌增殖和產酸效果的比較。因此，本試驗通過比較IMO和RFO對于乳酸桿菌增殖和產酸效果的能力，闡明IMO與RFO之間的作用效果,為低聚糖在畜禽生產上的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源

乳酸桿菌：德氏乳酸桿菌微膠囊粉制劑（活菌數≥1.01×109CFU/ml）由北京國家糧食局科學研究院生產包被，該菌種由湖南農業大學功能微生物實驗室篩選，武漢大學菌種保藏中心鑒定保藏（保藏號M207096）。

1.1.2 糖類

IMO和RFO由綠葉生物科技有限公司提供，500 g/瓶，純度98%。

1.1.3 培養基

MRS肉湯：用于乳酸桿菌的菌種活化，其配方（綠葉生物科技有限公司）如下：蛋白胨10.0 g，牛肉浸膏8.0 g，酵母浸粉4.0 g，葡萄糖20 g，磷酸氫二鉀（無水）2.0 g，檸檬酸三銨（無水）2.0 g，硫酸鎂0.2 g，四水硫酸錳 0.05 g，乙酸鈉5.0 g，吐溫-80 1.0 ml，蒸餾水1 000 ml，pH值(5.7±0.2)。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

MRS液體培養基：用于IMO和RFO對乳酸桿菌的體外增殖試驗。其配方（綠葉生物科技有限公司）如下：胰蛋白胨10.0 g，牛肉浸膏5.0 g，酵母浸粉4.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，檸檬酸三銨2.0 g，七水硫酸鎂0.2 g，四水硫酸錳0.05 g，乙酸鈉5.0 g，吐溫-80 1.0 ml，蒸餾水1 000 ml，pH值(6.2±0.2)，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.1.4 儀器

超凈臺（蘇州江東精密儀器有限公司SW-CJ-2FD）、恒溫生化培養箱（ADX-SHP）、高壓蒸汽滅菌鍋（立式壓力蒸汽滅菌鍋 LDZX-50KBS）、烘箱（JINGHONG公司XMTD-8222）、移液槍（LICHENG公司WKYIII-200）、PH計（德國德圖 testo 205）、酶標儀（Thermo公司 MULTISKAN GO）。

1.2 試驗設計

本試驗采用單因素試驗設計，分為對照（CON組，不含葡萄糖的MRS液體培養基）、IMO組（MRS中添加2.0%IMO）和RFO組（MRS中添加2.0%RFO），每組三個重復。分別于接種乳酸桿菌后0、8、16、24、32 h和40 h測定各處理培養基的OD值和pH值，并建立各組乳酸桿菌的生長曲線圖和發酵液pH值曲線圖。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 菌種活化

將乳酸桿菌菌粉接種在MRS肉湯培養基中，37 ℃、140 r/min搖床培養12～24 h，即為活化的乳酸桿菌菌液。

1.3.2 乳酸桿菌發酵液吸光度的測定

分別于接種后0、8、16、24、32 h和40 h用酶標儀測定發酵液的OD420值。細菌懸浮液的濃度在一定范圍內與透光度成反比，與光密度成正比，吸光度(OD值)可表示樣品菌液濃度[4]。

1.3.3 乳酸桿菌發酵液pH值的測定

于接種后0、8、16、24、32 h和 40 h用pH計測定發酵液的pH值。

1.3.4 數據處理

數據用Excel完成處理，采用SPSS 20.0軟件進行one-way ANOVA統計分析，若組間差異顯著，則采用Duncan's法進行多重比較，以P＜0.05為差異顯著。試驗結果以“平均數±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 低聚異麥芽糖和棉籽低聚糖對乳酸桿菌增殖的影響（見圖1）

由圖1可知，與對照組相比，低聚異麥芽糖和棉籽低聚糖均能顯著提高乳酸桿菌培養基OD值（P＜0.05）。發酵24 h之前，IMO組的乳酸桿菌數量顯著高于棉籽低聚糖組，但在24 h之后，RFO組中乳酸桿菌數顯著高于IMO組。

圖1 IMO和棉籽低聚糖對乳酸桿菌生長作用曲線

2.2 低聚異麥芽糖和棉籽低聚糖對乳酸桿菌發酵液pH值的影響(見圖2)

由圖2可知，與對照組相比，低聚異麥芽糖和棉籽低聚糖均能明顯降低乳酸桿菌發酵液pH值（P＜0.05）。發酵24 h之前，IMO組的乳酸桿菌發酵液pH值明顯低于RFO組（P＜0.05）；在發酵24 h之后，RFO組的發酵液pH值明顯低于IMO組（P＜0.05）。

3 結論與討論

乳酸桿菌作為益生菌在動物腸道中發揮著重要的作用。乳酸桿菌可以產生乳酸、過氧化氫和細菌素等抗菌物質[5-6]，增強上皮細胞的屏障功能和免疫功能[7-9]。IMO作為一種益生元，能夠有效地促進乳酸桿菌的增殖，具有調節消化道微生物區系的作用[10]。本試驗結果表明，離體培養條件下，IMO對乳酸桿菌呈現出明顯的增殖效果，其作用程度優于葡萄糖基礎培養基，這與李曉卉[11]和房曉等[12]的研究相似。研究表明，益生菌對低聚糖的利用情況不僅與益生元種類有關，也存在時間差異。萬榮峰等[13]在不含葡萄糖的肉湯培養基中添加低聚糖，乳酸桿菌在前24 h處于增值階段，而24～48 h乳酸菌數量呈現下降趨勢。在本試驗中IMO和RFO對乳酸桿菌的增殖與時間密切相關，在16 h前IMO組乳酸桿菌增值效果顯著升高，而在16 h之后無顯著變化，RFO組在24 h前乳酸桿菌增殖效果顯著升高，而在24 h之后無顯著變化，說明RFO的作用效果具有延后效應。

圖2 低聚異麥芽糖和棉籽低聚糖對乳酸桿菌發酵液pH值的影響曲線

IMO和RFO均能顯著降低培養基的pH值，但其作用效果因低聚糖的種類而異。IMO組在0～24 h內pH值顯著高于RFO組，而在24 h之后相反，說明乳酸桿菌對低聚糖的利用具有選擇性，24 h可能是不同種類低聚糖對腸道菌群影響的分界點，這與劉露等[14]的研究相似。本試驗表明，低聚糖對乳酸桿菌的pH值作用效果不僅與低聚糖種類有關，還存在時間差異。在16 h前IMO組pH值顯著降低，而在16 h后無顯著變化，RFO組在24 h前pH值顯著降低，而在24 h之后無顯著變化。產生這種作用效果的原因可能與糖分子的結構差異有關，不同低聚糖分子內的糖苷鍵對益生菌的生長會產生不同的效果。本試驗也證實了兩種低聚糖對乳酸桿菌生長的影響也存在差異。

低聚糖在單胃動物的胃內不能被消化酶分解，在小腸中幾乎不能被利用，主要在后腸中被腸道菌群選擇性發酵，大多數有益菌能利用低聚糖，但是對低聚糖呈現出偏好性，所以乳酸菌對IMO和RFO的利用情況是不同的，這呈現出了菌株的特異性。總體來說，乳酸菌的生長速度和產酸速率呈正相關，但這一現象并不絕對，例如生長速率接近的兩株干酪乳酸菌，產酸速率相差較大，說明即使是同一種菌，對同種低聚糖的利用特性也可能不同。劉思思[15]研究表明，菌株的定殖性能與菌株利用低聚糖的能力可能有關，但并不與低聚糖利用能力呈正相關，只有長期使用低聚糖，菌株的定殖性能才會延長。低聚糖對乳酸菌增殖的作用機理在于低聚糖不只充當一種碳源或營養物質，還可能參與了乳酸菌的生長調節。細菌利用低聚糖通常需要轉運蛋白和糖苷酶的參與[16],目前已在乳酸菌中分離出純化的β-葡萄糖苷酶、谷氨酸脫羧酶、脫氧胞苷激酶等，不同的酶活性不同，乳酸桿菌對IMO和RFO的利用率可能和這些酶與IMO和RFO的反應速率有關，后續可以從乳酸菌的代謝途徑或降解低聚糖的酶系統甚至是基因層面進行差異探究。

本試驗結果表明，IMO和RFO均能顯著促進乳酸桿菌的增殖，其作用效果與低聚糖的種類和時間有關。因此，生產中可根據目的合理的選擇低聚糖，也可根據不同低聚糖的作用進行組合使用。