三氧化二砷聯合小白菊內酯誘導人骨肉瘤細胞凋亡的實驗研究

滕松齡，陳兵，李崇杰

（沈陽醫學院附屬中心醫院 手外1科，遼寧 沈陽 110024）

骨肉瘤是高度惡性的間葉組織腫瘤，好發于青少年和年輕成人，骨肉瘤在局部呈侵襲性生長并且易發生轉移，現在多采用化療輔助手術的聯合療法。但因為骨肉瘤細胞對化療藥物缺乏敏感性，以及單一傳統化療藥物易產生的耐藥性，使得多種抗腫瘤藥物聯合輔助化療方案日益受到青睞。三氧化二砷（arsenic trioxide，ATO）已經被證明對于早幼粒細胞白血病及其他腫瘤細胞有誘導凋亡作用[1，2]。小白菊內酯(Parthenolide，PTL)是從草本類植物艾菊內純化出的一種倍半萜烯內酯化合物，近年來研究發現，小白菊內酯具有較強的抗腫瘤活性，在體外可抑制多種腫瘤細胞株的生長增殖，并誘導其凋亡[3]。此外，小白菊內酯還可以增強腫瘤細胞對其他多種抗腫瘤藥物的敏感性[4]。因此，我們將小白菊內酯與三氧化二砷通過單獨以及聯合作用于骨肉瘤U2OS細胞株，來觀察研究其誘導骨肉瘤細胞凋亡的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

人骨肉瘤U2OS細胞株采購自中國上海科學院生化細胞研究所，三氧化二砷（北京雙鷺藥業股份有限公司），小白菊內酯（索萊寶公司），DMEM培養基，胎牛血清（Thermo公司），MTS試劑盒（美國Promega生物科技公司），倒置相差顯微鏡（日本尼康公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

U2OS細胞培養于DMEM培養基中（含10%胎牛血清培養液），置于37℃，5%CO2細胞培養箱中，2～3 d傳代一次。

1.2.2 藥物的給予方法

0.25 %胰酶消化對數生長期細胞，計數后，按5×105/mL，將細胞接種于培養板中，待細胞貼壁后給藥。三氧化二砷組：1，2，4 μmol/L 三種濃度；小白菊內酯組：5，10，20 μmol/L三種濃度；以及三氧化二砷2 μmol/L分別聯合小白菊內酯5，10 μmol/L組，同時設立空白對照組。

1.2.3 應用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態學變化

取對數生長期的細胞用于實驗，單獨及聯合給予小白菊內酯以及三氧化二砷，于24 h后進行細胞形態學觀察。

1.2.4 MTS法檢測U2OS細胞增殖抑制率

采用MTS法檢測不同濃度三氧化二砷和小白菊內酯單獨及聯合作用對人骨肉瘤U2OS細胞株的增殖抑制率。給予不同濃度的藥物分別作用于U2OS細胞24，48及72h后，加入20μL/孔的MTS試劑，繼續培養4h，用酶標儀讀取每孔的吸光度值(OD=490nm)。細胞增殖率（%）=實驗組OD值／對照組OD值×100%。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 倒置相差顯微鏡觀察U2OS細胞形態學變化

分別給予劑量為 PTL 2 μmol/L，ATO 5 μmol/L以 及 ATO 2 μmol/L+PTL 5 μmol/L 和 ATO 2 μ mol/L+PTL 10 μmol/L，24 h后觀察骨肉瘤 U2OS細胞。同空白對照組相比，治療組細胞均出現變小變圓，有不同程度的萎縮。而與單獨用藥組相比，聯合用藥組細胞破壞程度進一步增加，許多細胞脫落后漂浮于培養液中，更多的細胞進入凋亡狀態（圖1）。

圖1 單獨及聯合應用三氧化二砷、小白菊內酯作用于U2OS細胞的形態學變化

2.2 不同濃度的三氧化二砷和小白菊內酯單獨及聯合用藥對骨肉瘤U2OS細胞增殖的影響

2.2.1 單獨應用三氧化二砷對U2OS細胞的影響

三氧化二砷對骨肉瘤U2OS細胞具有增殖抑制作用，隨著濃度的增大及時間的增加，抑制作用也逐漸增加（P＜0.05，圖 2）。

2.2.2 單獨應用小白菊內酯對U2OS細胞的影響

結果表明小白菊內酯可抑制U2OS細胞的增殖，同時同樣存在濃度及時間依懶性，不同濃度及時間點相比較差異有顯著性（P＜0.05，圖3）。

圖2 三氧化二砷單獨作用于U2OS細胞，分別在24,48,72 h計算出生存率

圖3 小白菊內脂單獨作用于U2OS細胞，分別在24,48,72 h計算出生存率

2.2.3 聯合應用三氧化二砷及小白菊內酯對U2OS細胞的影響

兩個聯合應用組分別作用于骨肉瘤細胞，MTS法檢測其24，48，72 h的生存率，結果表明，聯合給藥組也同樣存在劑量與時間的依賴性，且聯合給藥組對于骨肉瘤細胞U2OS的增殖抑制作用明顯好于單獨給藥組（P＜0.05，圖 4，5）。

圖4 ，5 聯合應用作用于U2OS細胞，分別在 24，48，72 h 計算出生存率

3 討論

三氧化二砷可以通過多種信號通路促進腫瘤細胞的凋亡[5，6]，我們的實驗結果也再次證明了三氧化二砷對骨肉瘤U2OS細胞存在增殖抑制作用，且具有時間與劑量的依賴性。但我們考慮到三氧化二砷在高濃度下的毒副作用以及單一用藥時產生的耐藥性等問題，從而想尋找一種可以與其協同作用，增加療效的藥物。小白菊內酯為一種倍半萜稀內酯化合物，其已被證明可通過抑制NF kappa B的激活從而誘導腫瘤細胞的凋亡[7]，同時亦發現其可以作為某些腫瘤的放療或化療的增敏劑[8-10]。本研究顯示應用三氧化二砷聯合小白菊內酯的聯合給藥組，對骨肉瘤U2OS細胞的增殖抑制作用明顯高于單獨給藥組，同時我們發現，聯合給藥組（2μmol/L三氧化二砷聯合10 μmol/L小白菊內酯）在早期（24 h），即可達到很高的抑制水平，U2OS細胞的增殖抑制率為（71.9±1.64）%。而三氧化二砷及小白菊內酯單獨給藥組的增殖抑制率僅為（26.01±3.73）%及（27.82±0.74）%。在較低濃度的小白菊內酯及三氧化二砷聯合給藥組也在48 h后對U2OS細胞的抑制率達到了（72.46±2.13）%，而三氧化二砷與小白菊內酯在同一時期的增殖抑制率為（39.76±1.29）%及（25.61±2.45）%。本實驗結果表明，聯合應用小白菊內酯及三氧化二砷對于誘導骨肉瘤U2OS細胞的凋亡具有協同作用，并存在時間與劑量的依賴性，同時在較低的給藥濃度的條件下，就可達到較理想的協同抑制效果。因此，我們認為把三氧化二砷與小白菊內酯聯合應用于骨肉瘤的臨床治療，有著良好的前景。同時，對于三氧化二砷及小白菊內酯對骨肉瘤U2OS細胞的作用機制等問題，還需進一步的研究。