MoFlo XDP超速流式細胞分選儀的管理及維護*

陳云鳳 龍 釗 王曉紅 許佳玲 羅劍文 張以順*

流式細胞分選儀可對快速、直線及流動狀態中的單個細胞或其他微粒進行逐個、多參數和快速定性定量分析，同時可對特定群體精確識別并分離的現代細胞分析技術設備[1-3]。MoFlo XDP超速流式細胞分選儀(美國Beckman Coulter公司)是細胞生物學、單克隆抗體技術、激光技術、流體力學、電子計算機等學科高度融合發展的結晶[4-6]。流式細胞技術已被廣泛應用于細胞生物學、腫瘤學、免疫學、血液學、病理學、臨床檢驗、藥理學、農業及畜牧業等領域[7-11]。

流式細胞分選技術具有高通量、分選速度快、分選細胞純度高和活性好等技術優勢，但當分選前調校和操作較為復雜費時，如果分選的每個步驟操作不當或儀器參數設置不準確，則會對分選出目標細胞的活性、純度、得率和分選速度有較大影響，甚至縮短儀器的使用壽命[12]。為此，本研究對中山大學生物學國家實驗教學示范中心使用7年的MoFlo XDP超速流式細胞分選儀管理方法進行探討。

1 MoFlo XDP超速流式細胞分選儀的管理

1.1 實驗室環境

流式細胞分選儀的性能和使用壽命受環境溫度、濕度及清潔度等方面的影響。流式細胞分選儀室必須是一個全密封的環境，配有冷暖空調、紫外燈和抽濕機，應具有配備冷暖空調、紫外消毒的緩沖間，防止污染。真空泵和壓縮機置于緩沖間，可減少流式細胞儀室的噪音。

1.2 儀器管理員

大型科研設備的管理實行專管共用原則，集中于實驗教學中心，實行校內外共享服務，由專職儀器管理員進行儀器的操作和日常維護[13-14]。專職管理員于實驗前介入師生的相關實驗內容，閱讀相關資料，結合自己的操作經驗，指導師生完善實驗樣品制備和實驗方案設計，確保師生的實驗順利完成。

流式細胞分選儀的開機、調節和關機必須由管理員完成。流式細胞分選儀的光路和流路比較復雜，濾光片很靈敏，濾光片位置一點點變化就會引起光路很大偏差[15]。管理員具備熟練的操作方法，可在短時間內把光路和流路調好。如果讓師生完成這些工作，可能出現：①光路偏離太多，需要管理員或工程師花很長時間才能矯正；②調節旋鈕的螺紋滑絲，影響光路和流路的精確性；③因忘記關激光、壓縮機等而降低儀器的性能和縮短使用壽命。

1.3 培訓與交流

(1)管理員培訓與交流。學院對大型科研設備管理員的技術培訓與交流主要采取送出去和請進來兩種方式。每年學院利用學校給予的政策與經費支持，有針對性地安排相關設備管理員到國內外高校和儀器公司進行參觀、學習和交流[13]。并邀請儀器生產廠家的專業技術人員到學院儀器現場開展定向培訓。

(2)師生培訓與交流。使用流式細胞分選儀的師生需要對其原理、性能及適用范圍等有個大概的認知，才能針對不同的實驗材料采取最適合的實驗技術和方案。

(3)師生主動提前介入。將流式細胞術的基本原理和應用納入一年級本科生和研究生的《生物學儀器設備技術》課程。同時，邀請專家和工程師給師生們開展實驗技術及應用交流討論。

(4)管理員與師生合作交流。由于實驗教學中心的大型儀器都是實行校內外共享，師生需要在網上預約和經過上機培訓后才能使用儀器[13]。儀器管理員與使用師生之間只有保持高度默契的合作交流，才能確保儀器的正常運行和取得好的實驗結果。

2 MoFlo XDP超速流式細胞分選儀操作維護技巧

管理員在操作流式細胞分選儀時，要善于觀察，總結操作經驗和技巧。儀器最佳條件的設定和參數的調試直接關系到分析的精確度和分選的產率、純度及活力等結果[16]；正確的操作經驗和技巧是為了維持儀器的良好性能和延長儀器的使用壽命。

2.1 開機

開機前不需要每次更換噴嘴(cyto nozzle)，盡量減少噴嘴的更換次數來保護噴嘴固定器的螺紋。開機后需要等流路沖洗干凈和激光達到穩定時才能調流路和光路，增加其精確性。

2.2 流路調節

調流路前必須排氣泡，氣泡會嚴重影響智能分選模式的穩定。通常要上下移動多次噴嘴才能將流路調正，所以要觀察噴嘴在最低和最高時千分尺的位置，避免調得過低或過高造成螺紋滑絲和流動室組件脫落。噴嘴降到最低處時，千分尺的刻度通常在5以上2～3格；噴嘴升到最高處時，千分尺的刻度通常在15以上1～2格(如圖1所示)。

噴嘴位于最低處時，小孔(pin hole)應調在液流最中間；噴嘴位于最高處時，如果液流偏小孔太多，要將液流調至偏向相反一側。這樣可以減少噴嘴上下移動次數， 更快調正液流和減少螺紋的磨損(如圖2所示)。

圖1 調液流時噴嘴的位置示圖

圖2 液流調節示圖

2.3 光路調節

(1)用熒光微球調光路時，如果發現上樣細胞數值為0，原因可能有未開激光、樣品壓力低于鞘液壓力、光路未調好、流路堵塞及閾值設置不好；如果發現上樣細胞數值很大，原因可能有前向散射光(forward scatter，FSC)未調好、流路堵塞了和面板上FSC閾值被改變為其他通道閾值。

(2)多激光檢測時，要先調好藍激光通道的變異系數(coefficient of variance，CV)值(如圖3所示)。①先調液流組的微調千分尺的左右鍵和聚焦鍵，兩個鍵輪流調，把光斑調至最上、最右且最聚集，當發現光斑由不均一的紅色和黃色混合的射線(圖3-A)突然變成聚集的黃色斑點(圖3-B)時，再調激光組；②調激光組時，一般只調上下和前后的微調千分尺，聚焦千分尺影響較小；③藍激光調好后，再調其他激光的通道；④若每次實驗把噴嘴降低到相同位置，其他激光的光路常不需要調節CV值即可＜3%。

圖3 光路調節示圖

(3)由于濾光片比較靈敏，如果能通過以上流路和光路調節得到理想的CV值，則不要調濾光片，否則要花更多的時間去矯正光路。

2.4 智能分選模式(IntelliSort State)的建立

(1)為防止樣品污染，建立智能分選模式前，用75%的乙醇高速上樣5 min對流路進行消毒，再用無菌水高速上樣5 min。

(2)調Charge Phase(充電相位)和分選時，電極板會出現加電不正常，液滴在電極板之間來回運動，最終影響智能分選模式的建立和降低分選純度。最佳的糾正方法是：①用蒸餾水沖洗電極板上的結晶鹽，用無屑紙擦干凈后再裝上；②調Charge Phase時電壓不要超過2700 V；③目的細胞含量高時，降低電壓使偏轉液流遠離偏轉板，或者將樣品稀釋使偏轉液流變細。

(3)理想的分選模式為：①最后一個連接液滴被粗細均勻的衛星液滴掛住；②最后一個連接液滴與斷開液滴之間的衛星液滴呈粗細均勻的直線，位于兩個液滴中間；③對于100 nm的噴嘴，Maintaining(智能分選模式的維持)的指示線一直保持在最高點。分選模式如圖4所示。

圖4 理想的智能分選模式(IntelliSort State)示圖

2.5 檢測和分選

(1)檢測。先檢查樣品的質量狀況，樣品若帶有培養基、未過濾或細胞凝聚成團會堵塞流路。

(2)分選。上樣、分析和分選操作，經過管理人員多次培訓后由使用師生獨立完成。對師生要進行以下操作和注意事項培訓：①用75%酒精棉球擦拭分選窗，防止樣品污染；②為保持智能分選模式的穩定，要等上樣準備就緒，發現有穩定的每秒細胞數(events per second， EPS)時，才開啟電腦上的分選，反之，要先停止電腦上的分選，才能在面板上操作暫停或停止上樣；③上樣和停止上樣是同一個按鈕，所以只能按一次按鈕，耐心等待上樣器的開門和關門，如果連續按兩次或更多次，上樣器的門會開了又關，同時上樣針會上升了又下降，這時候取樣品可能會造成上樣針和上樣器損壞，還可能引起手受傷事故；④面板上出現對話提示框，當智能分選模式已不能維持，應立即停止分選，避免目的細胞的分選純度受影響；⑤如發現EPS越來越少，可能是待分選樣品沉底或聚集了，應停止分選，混勻后再上樣分選；⑥如出現EPS越來越多，這時流路開始堵塞，應立即停止分選，用無菌水高速上樣沖洗，及時發現這種情況并沖洗流路可防止流路嚴重堵塞甚至損壞；⑦要留意樣品的液面高度，切勿讓上樣針露出液面吸入氣泡而影響智能分選模式的穩定。

2.6 關機

(1)為了更好地維護和保證流式細胞分選儀下次實驗能順利進行，需由管理員完成關機。防止流路堵塞和提高儀器的使用效率的方法有：①高速沖洗流路，用1%次氯酸鈉洗滌前需用無菌水沖洗，盡量把流路中殘留的細胞沖洗掉，如果直接用1%次氯酸鈉沖洗，會造成太多細胞在流路中破裂，細胞碎片在流路中積累越來越多而堵塞流路；②每次實驗后加滿鞘液，鞘液經靜置后可以減少氣泡。

(2)延長儀器使用壽命的注意事項有：①先將激光鎖匙旋到關閉，使激光慢慢降溫，15 min后關閉激光電源，可延長激光的壽命；②關閉液流顯示燈，可延長燈泡壽命。

3 MoFlo XDP超速流式細胞分選儀管理效果

通過對MoFlo XDP超速流式細胞分選儀的管理與維護取得了較好的效果，從實驗室環境、儀器管理員、培訓與交流等方面積累了豐富的管理和維護經驗。近年來，儀器公司多次組織相關部門的流式細胞儀操作者來學院進行培訓。通過管理和維護，MoFlo XDP超速流式細胞分選儀使用機時超過10000 h，從未出現過流路嚴重堵塞、樣品污染等不良現象，仍然保持良好的分選效率，分選純度仍保持在99%以上，并延長了設備的使用壽命。

4 結語

流式細胞分選儀是多門學科綜合的結晶，被廣泛應用于生物學、醫學等領域，管理和維護以及更好地開發利用流式細胞分選儀的功能，是管理員需要繼續深入研究的課題。流式細胞分選儀管理員和科研人員需要不斷地有意識地學習各門相關學科知識，以便更好地將流式細胞分選儀應用到各學科的教學和科研中。