激光共聚焦顯微鏡對樣品檢測中的溫度變化及不同固定方法的研究

肖忠新 趙媛媛*

隨著我國高校辦學條件的不斷改善，高校擁有的大型儀器逐漸增多，其中包括激光掃描共聚焦顯微鏡精密大型儀器，該儀器設備可以對樣品進行斷層掃描和成像，無損傷地觀察和分析細胞的三維空間結構，已廣泛應用在細胞生物學、生理學、醫學免疫學及藥劑學等研究領域。使用激光掃描共聚焦顯微鏡檢測，對樣品具有嚴格要求。有研究指出，樣品所處環境溫度會影響樣品熒光強度的觀測[1-2]。為此，本研究采用4%多聚甲醛緩沖液和甲醇兩種常規的固定劑，使用之后再加促滲透試劑TritonX-100，觀察其對細胞核染色圖像質量的影響，通過樣品的溫度改變和不同樣本固定方法，分析其對激光共聚焦顯微鏡觀測結果的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

使用Leica TCS SP5型激光共聚焦顯微鏡(德國Leica公司公司)觀測樣品。植物鈴蘭(Convallaria)樣片(德國Leica公司)胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(美國Gibco公司)；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)復染液(英國Abcam公司)染料；多聚甲醛緩沖液(江蘇凱基生物公司)；甲醇(分析純，北京化工廠)。激光共聚焦皿[耐思(NEST)江蘇無錫耐思生物科技有限公司。

1.2 檢測樣品

檢測的樣品為植物鈴蘭(Convallaria)樣片，樣片用Fast Green和Safranin兩種染料染色，并使用了防淬滅劑。檢測不同固定方法的樣品為人正常肺上皮細胞(BEAS-2B)。用含體積分數為10%的FBS高糖培養基(dulbecco′s modified eagle medium，DMEM)，含封片劑的DAPI復染液染料，4%的多聚甲醛緩沖液，甲醇，20 mm激光共聚焦皿(NEST)。

檢測溫度對共聚焦顯微鏡影響的樣品為德國Leica公司提供的經過熒光染色的植物鈴蘭(Convallaria)樣片，樣片用Fast Green和Safranin兩種染料染色，并使用了防淬滅劑。檢測不同固定方法的樣品為人正常肺上皮細胞(BEAS-2B)， 在20 mm激光共聚焦皿中培養。樣品依據處理方法的不同分為A組和B組，A組為甲醇處理組(3個皿)，B組為甲醛處理組(3個皿)，A組分別使用4%的多聚甲醛緩沖液，甲醇固定。B組在其固定后再加促滲透試劑TritonX-100處理。人正常肺上皮細胞均使用含封片劑的DAPI復染液對細胞核染色。

圖1 常溫下鈴蘭樣品熒光強度的變化曲線圖

1.3 檢測方法

1.3.1 分子熒光強度的測定

使用TCS SP5型激光共聚焦顯微鏡檢測植物鈴蘭(Convallaria)樣片。物鏡為63倍油鏡，數值孔徑值為1.4。利用561 nm激光器激發熒光，探測器在610～691 nm接收發射光。同一個鈴蘭樣片在兩種溫度下進行測定：①在室溫下測定；②在冰箱-20 ℃冷凍保存12 h，取出后立即用激光共聚焦顯微鏡觀測樣片熒光強度的變化，隨著時間的增加，鈴蘭樣品溫度逐步升高。采集鈴蘭樣片圖像時間均為間隔5 min采集1次，在同一個視野中連續采集圖像7次，總共采集30 min。室溫下和-20 ℃冷凍保存的鈴蘭樣片是在相同的掃描參數情況下，使用激光共聚焦顯微鏡觀測、采集圖像。分析圖像熒光強度是用萊卡公司LAS AF Lite軟件，計算每幅圖像中的平均熒光強度。

1.3.2 人正常肺上皮細胞固定方法的測定

(1)樣本固定。人正常肺上皮細胞(BEAS-2B)復蘇后傳代3代后用于實驗，分為A組和B組，A組采用甲醇處理(3個皿)；B組采用甲醛處理(3個皿)。吸凈培養基，用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)沖洗1次，馬上加入細胞固定劑。①A組甲醇處理(3個皿)方法：置于-20 ℃預冷的甲醇固定10 min，其中兩個皿僅加PBS，不加TritonX-100，另一個皿加0.3% TritonX-100作用15 min；②B組甲醛處理(3個皿)方法：使用新鮮配置的4%多聚甲醛緩沖液室溫固定15 min，吸出甲醛，其中兩個皿僅加PBS，不加TritonX-100，另一個皿加0.3%TritonX-100孵育15 min。

(2)細胞核染色。用封片劑含DAPI的染料染色10 min后，使用PBS清洗3次，每次5 min，然后每個皿再加入適量PBS。

(3)染色情況。使用TCS SP5型激光共聚焦顯微鏡觀察DAPI染色情況，各皿所使用物鏡均為63倍油鏡，數值孔徑值為1.4。采集熒光和明場圖像，單個細胞的圖像放大4倍拍攝。使用405 nm激光器激發DAPI染料，各皿的掃描參數固定不變。

2 實驗結果

2.1 溫度對熒光分子熒光強度的影響

(1)在常溫下鈴蘭樣品熒光強度的變化很小，曲線接近一條水平直線(如圖1所示)。

(2)隨著時間的增加，鈴蘭樣品溫度增高，逐步達到室溫(23℃±1℃)時，平均熒光強度逐漸增強。在接近室溫時，曲線上升趨勢漸弱，曲線趨于平緩(如圖2所示)。

圖2 -20℃冷凍保存恢復到室溫下鈴蘭樣品熒光強度的變化曲線圖

2.2 不同固定方法對細胞核染色的影響

采用4%多聚甲醛緩沖液和甲醇兩種固定劑固定后，用DAPI對胞核染色的效果均不如加入促滲透試劑TritonX-100對核染色效果好，加入促滲透試劑后，核染色更均勻，且更堅實、清晰(如圖3所示)。

圖3 不同固定方法對細胞核染色的影響示圖

3 討論

按照常規，熒光物質的熒光強度在低溫時比高溫時要高，而樣品加封片劑后，需考慮封片劑對熒光強度的影響。有研究指出，保存熒光樣品的丙三醇含量會影響對生物介質中不同發射波長熒光分子的熒光強度[3]。

本實驗研究結果顯示，冷凍保存的熒光樣品溫度逐步達到室溫時，熒光強度會逐漸增強，這與本研究偶爾遇到剛從冰箱冷凍保存的樣品取出來，著急使用共聚焦顯微鏡檢測熒光強度的結果相似。有研究表明，黏度增加使得熒光光強增加[4-7]。Kee等[8]的研究也提示熒光量子產率隨黏度的增加而增大。樣品熒光強度逐漸增強可能的原因是隨著溫度的升高，樣片中的封片液逐漸解凍，處于低溫下的封片液比常溫下的黏度大，從而導致熒光發射強度增強。

固定劑影響樣品觀測已有報道，范瑾瑾等[9]的研究提示，對細胞支架成分的固定適用于有機溶劑固定劑，交聯劑固定劑適用于膜相關成分的固定；張麗麗等[10]的實驗表明，95%乙醇或甲醇作為固定劑固定細胞后，易導致熒光猝滅；而丙酮或4%多聚甲醛固定細胞后，對質粒熒光強度沒有顯著影響。本研究結果表明，樣品使用交聯型固定劑4%多聚甲醛或凝固型固定劑甲醇固定以后，如果再繼續加入促滲透試劑TritonX-100，可以使細胞核的通透性增加，便于DAIP與核酸更好地結合，細胞核染色效果更清晰。

4 結語

熒光樣本所處環境溫度的改變會引起熒光強度的變化，在做熒光強度比較的實驗時尤其要注意，應在室溫下，同一個溫度條件進行檢測。從冰箱冷凍保存取出的樣本應在室溫下放置30 min以后，再使用激光共聚焦顯微鏡進行熒光強度測試。樣品在一般固定劑固定以后，再加入促滲透試劑可以使細胞的通透性增加，染色更加清晰。在使用激光共聚焦顯微鏡時，如果不注意溫度的改變和固定方法，將影響觀測結果。