Tim-3在胃癌組織中的表達及其臨床病理特征和生存的關系*

王良義 林中滿 王德奮

在我國胃癌的發病率居各類惡性腫瘤之首，其發生、浸潤、轉移、復發等過程涉及多種細胞因子及其相關的調控網絡通路和分子機制。研究表明，胃癌的轉移復發不僅依賴于癌細胞本身的生物學特性，腫瘤微環境中各種細胞因子與腫瘤細胞之間的作用及其各種細胞因子的相互作用也對腫瘤惡性增殖、浸潤、轉移等惡性進展的發生具有重要影響[1-2]。因此，不斷探索新的基因功能和完善分子間相互作用仍是目前的研究熱點。T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子3(T-cell immunoglobulin domain and mucin domain protein-3，Tim-3)屬于Tim基因家族蛋白，特異性表達在CD4+IFN-γTh1細胞表面，隨著其研究的深入，發現Tim-3在T細胞亞群CD3+CD8+T細胞、輔助性T細胞17(T helper cell 17，Th17)、調節性T細胞(regulatory cells，Treg)、樹突細胞(dendritic cell，DC)、自然殺傷細胞(natural killer，NK)等其他淋巴細胞亞群也均有表達[3]。Tim-3屬于細胞免疫抑制分子，負向調控Th1細胞，通過Tim-1/galeetin-9途徑對免疫耐受起著重要的調節作用[4]。

近年來，越來越多的研究將關注點集中在Tim-3對腫瘤免疫的作用機制上。有研究發現，Tim-3通過調節T細胞保持腫瘤免疫抑制環境，與腫瘤的惡性進展緊密相關[5-6]。本研究應用免疫組織化學方法檢測胃癌組織中Tim-3的表達及其臨床意義，旨在探討Tim-3與胃癌的臨床病理特征和生存的相關性及其所起的作用機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2009年9月1日至2012年9月1日瓊海市中醫院收治的56例行胃癌根治術患者的病例資料。56例患者中男性34例，女性22例；年齡29～74歲，平均年齡(56.4±6.4)歲。采集56例患者手術切除的胃癌組織標本及相同病例的癌旁組織標本，經10%中性甲醛固定，石蠟包埋、連續切片。本研究已經通過醫院倫理委員會審查，患者均知情同意。

1.2 納入與排除標準

(1)納入標準：①術前均經病理學檢查確診為胃癌；②行胃癌根治術；③臨床資料及其手術切除標本蠟塊保存完整。

(2)排除標準：①術前曾經接受放化療、免疫及抗腫瘤藥物等治療；②合并其他惡性腫瘤。

1.3 儀器與試劑

采用自動免疫組織化學分析儀(德國徠卡Bond公司)；Elivsion試劑盒、DAB顯色試劑盒以及兔抗人Tim-3多克隆抗體均購自丹麥Doka公司。

1.4 檢測方法

免疫組織化學檢測Tim-3的表達采用Elivsion免疫組織化學法，檢測胃癌組織及其癌旁組織中Tim-3的表達采用Elivsion試劑盒、DAB顯色試劑盒以及兔抗人Tim-3多克隆抗體。嚴格按照二步法免疫組織化學試劑盒說明書進行操作。

1.5 觀察與評價指標

(1)結果判斷。陽性表達為定位于腫瘤細胞漿或細胞膜的棕黃色或棕褐色顆粒。由兩位病理醫師采用雙盲法進行判定，每張切片隨機選取5個高倍視野(×400)，每個視野數100個細胞，按陽性細胞所占百分比評分：陽性細胞＜10%為陰性(-)，≥10%為陽性(+)。

(2)生存率隨訪。所有患者出院后通過電話，郵件及上門隨訪生存情況，隨訪終止日期為2017年9月1日，或死亡日期為止。隨訪患者生存期，平均隨訪時間為(40.7±38.7)個月。

1.6 統計學方法

采用SPSS 13.0統計軟件進行數據分析，不同臨床病理特征患者的Tim-3蛋白表達比較運用卡方檢驗，生存資料作Kaplan-Meier生存曲線并Logrank檢驗和多因素分析(Cox模型)和相對危險度(relative risk，RR)分析，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 胃癌及癌旁組織中Tim-3表達比較

Tim-3在胃癌組織中的陽性表達率(85.71%)顯著高于癌旁組織(21.43%)，差異具有統計學意義(x2=46.52，P＜0.01)，如圖1所示。

圖1 Tim-3在不同組織中的陽性表達

2.2 胃癌組織中Tim-3表達與胃癌臨床病理特征的關系

TNM分期為Ⅲ～Ⅳ、伴有淋巴結轉移及浸潤深及肌層的患者胃癌組織中Tim-3表達明顯高于TNM分期為I～Ⅱ、無淋巴結轉移及未浸潤深及肌層的患者，差異有統計學意義(x2=9.962， x2=8.692， x2=6.941；P＜0.01)；而患者年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤的大小以及組織學分化對胃癌組織中Tim-3表達無顯著影響(x2=0.012，x2=0.013，x2=0.080，x2=0.051，x2=0.133；P＞0.05)，見表1。

2.3 Tim-3陽性表達與胃癌患者預后的關系

本研究對56例胃癌患者進行了隨訪，隨訪率為100.00%，其中40例存活，16例死亡；生存時間(32.17±7.93)個月。Tim-3陽性表達患者的Kaplan-Meier生存率曲線如圖2所示。

對56例胃癌患者的臨床病理資料進行Cox單因素回歸模型分析，其結果顯示，浸潤深度、淋巴結轉移、TNM分期以及Tim-3陽性表達與胃癌患者生存率明顯相關(r=0.674，r=0.613，r=0.596；P＜0.05)；Cox回歸多因素分析表明，浸潤深度、淋巴結轉移以及Tim-3陽性表達是影響胃癌患者生存率的獨立預后因素(RR=2.806，RR=2.239，RR=1.938；P＜0.01)，見表2。

表1 Tim-3表達與胃癌臨床病理特征的相關性

圖2 Tim-3陽性及陰性胃癌患者的生存曲線圖

表2 胃癌患者生存率的Cox回歸多因素分析

3 討論

胃癌患者的臨床表現多為遠期預后不良，治療效果不佳。目前胃癌發生、發展機制尚不完全清楚，其臨床遠期預后往往不佳，因此深入探討胃癌發生、增殖、浸潤、轉移、復發等惡性進展的作用機制，以尋找評估胃癌進展和預后的新指標，并為胃癌的免疫治療提供新的分子靶點，對降低胃癌患者的病死率具有重要的臨床價值。惡性腫瘤細胞的生長、增殖及浸潤離不開腫瘤免疫抑制微環境，這種免疫抑制微環境不僅是腫瘤失控性生長的土壤，更能幫助腫瘤細胞抵抗和抑制機體的抗腫瘤免疫應答。目前，已經發現免疫系統中一群抑制性受體，如細胞毒性淋巴細胞相關抗原4(cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4，CTLA-4)在腫瘤免疫逃逸過程中起主要作用，但其如何幫助腫瘤細胞逃避機體免疫監視和攻擊的具體作用機制尚不明確，也是目前腫瘤免疫研究中關注的熱點[7]。

Tim-3作為一個新發現的Th1細胞表面標志分子，由之前被認為是一種負性調節分子，現在被歸類于免疫系統中抑制性受體，和程序性死亡分子-1(programmed death-1，PD-1)及CTLA-4等一樣，被視為免疫過程中的關卡分子。近幾年，越來越多的學者關注于其結構、功能及其與自身免疫性疾病、過敏性疾病和免疫耐受甚至抗腫瘤免疫的關系，目前有關Tim-3在腫瘤中的研究大多集中在基礎研究階段，較多腫瘤細胞實驗過程均檢測到Tim-3異常表達，認為Tim-3在腫瘤免疫逃逸和抑制腫瘤免疫應答中扮演著非常重要的角色，推測其機制可能與Tim-3能夠介導T細胞耗竭或促進髓系來源抑制細胞增殖的功能有關[8-9]。近來研究資料發現，Tim-3不僅參與了一些上皮來源性惡性腫瘤，如胃癌、宮頸癌、肺癌、前列腺癌等的發生過程，更可能與腫瘤的轉移及患者的不良預后密切相關[10-12]。但國內有關胃癌中Tim-3的表達及功能研究并不多見[13]。本研究通過免疫組織化學方法測定Tim-3在胃癌組織中呈異常高表達，明顯高于癌旁組織，兩者差異具有統計學意義。與此同時，TNM分期為Ⅲ～Ⅳ、伴有淋巴結轉移及浸潤深及肌層的患者胃癌組織中Tim-3表達明顯高于TNM分期為I～Ⅱ、無淋巴結轉移及未浸潤深及肌層的患者，提示其在胃癌組織中的異常高表達不僅參與了胃癌的發生，可能更進一步參與胃癌的惡性進展，檢測到Tim-3高表達的患者可能提示了其腫瘤惡性進展的風險比較高，因此Tim-3有望成為胃癌分子靶向調控的重要靶點，將為胃癌免疫治療提供新途徑。

近年來，Tim-3與腫瘤預后的臨床相關性研究已成為熱點。為此，本研究對Tim-3表達與胃癌患者預后的關系進行了初步探討發現，Tim-3高表達的胃癌患者生存率明顯低于Tim-3低表達者，而多因素Cox比例風險模型分析顯示，Tim-3表達水平是影響胃癌患者生存率的獨立危險因素之一，提示胃癌組織中Tim-3的表達差異可能影響其患者的預后，推測這可能與Tim-3促使腫瘤浸潤T細胞發生功能耗竭有關，故Tim-3有望成為胃癌早期預后評估的重要分子。

Tim-3在胃癌組織中檢測到高表達，其表達與患者TNM分期、淋巴結轉移以及是否浸潤深度存在一定相關性。同時，胃癌組織中Tim-3的表達差異可能影響其患者的生存率，但其如何影響胃癌發生、進展及預后的作用機制尚有待進一步研究。