單核苷酸多態(tài)性(SNP)分子標(biāo)記在小麥遺傳育種中的研究進(jìn)展

吳 澎，劉 娟，田紀(jì)春

（1山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院/山東省高校食品加工技術(shù)與質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安271018；2山東農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥品質(zhì)育種研究室/山東省作物生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安271018）

0 引言

單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism，SNP)是指基因中的某個(gè)堿基對(duì)出現(xiàn)替換、缺失或者增添而引起的堿基序列發(fā)生改變最終導(dǎo)致DNA序列的多樣性，其中某一等位基因的突變頻率應(yīng)大于1%。SNP在基因組中分布廣泛，平均每數(shù)百bp就存在一個(gè)SNP[1]。相較于其他的重復(fù)序列，SNP在定位目標(biāo)基因、構(gòu)建高密度遺傳圖譜和群體結(jié)構(gòu)分類等方面，具有更大的使用價(jià)值和發(fā)展空間。隨著SNP分析檢測(cè)手段的迅猛發(fā)展，尤其是與芯片技術(shù)和基因克隆的結(jié)合，使其成為繼RFLP和SSR等標(biāo)記之后最具有發(fā)展?jié)摿Φ牡谌肿訕?biāo)記[2]。

近年來，結(jié)合農(nóng)業(yè)生產(chǎn)技術(shù)和高效農(nóng)藥的應(yīng)用，作物育種技術(shù)在提高作物農(nóng)產(chǎn)量等方面取得較大的成功，但依然面臨著諸多挑戰(zhàn)。首先，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐發(fā)生改變，這就需要開發(fā)具有特定農(nóng)藝性狀的作物；其次，種植環(huán)境也在發(fā)生變化，使得作物需要適應(yīng)不斷變化的生長(zhǎng)條件；最后，消費(fèi)者的需求發(fā)生變化。因此，需要不斷培育新品種來滿足市場(chǎng)的不同需求。小麥?zhǔn)侵袊?guó)重要的糧食作物，其面制品更是中國(guó)北方人民的主食[3-5]。隨著生活水平的提高，人們對(duì)面制品的要求已從滿足溫飽上升到具備良好感官品質(zhì)。而獲得優(yōu)質(zhì)面制品的基礎(chǔ)是高品質(zhì)的原料。因此，加強(qiáng)小麥等多倍體作物的SNP研究，不僅可應(yīng)用于遺傳選擇育種技術(shù)培育高產(chǎn)量、抗病等小麥品種，還可用于培育制作高檔面制品的特定小麥品種。本研究擬就SNP的特點(diǎn)與檢測(cè)方法做簡(jiǎn)單概括，同時(shí)對(duì)近幾年來SNP在小麥作物中的應(yīng)用進(jìn)行綜述和展望，以便育種工作者以及研究者們能對(duì)SNP在小麥作物上的應(yīng)用有全面的了解，根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行相應(yīng)的育種工作，并為SNP標(biāo)記在面制品中的研究應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 SNP的特點(diǎn)

近年來，人們對(duì)SNP的研究力度、范圍都在逐漸擴(kuò)大，從對(duì)人類和動(dòng)物基因的研究擴(kuò)展到對(duì)農(nóng)作物的研究，從二倍體作物基因的研究擴(kuò)展到多倍體作物研究。顯然，SNP已經(jīng)成為了基因研究的前沿方法，這是因?yàn)榕c傳統(tǒng)標(biāo)記相比SNP標(biāo)記有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。

1.1 位點(diǎn)多，分布廣

SNP在基因組中的密度較SSR等標(biāo)記高，且數(shù)量多、分布廣，可以在待測(cè)基因的附近或內(nèi)部提供一系列的標(biāo)記。Nasu等[6]分析比較了5個(gè)不同水稻品種之間SNP的頻率，結(jié)果得到在水稻基因組中每232個(gè)堿基就會(huì)存在1個(gè)SNP。此外，前人的研究表明，在大豆基因組中，平均272個(gè)堿基存在1個(gè)SNP位點(diǎn)[7]。在玉米基因組中，平均57個(gè)堿基存在1個(gè)SNP[8]。而Lammer等[9]通過對(duì)5個(gè)大麥品系的54個(gè)基因進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)大麥的38個(gè)基因中共存在112個(gè)SNP。

1.2 易實(shí)現(xiàn)分析的自動(dòng)化

第三代SNP標(biāo)記擺脫了傳統(tǒng)分子標(biāo)記需要的耗時(shí)長(zhǎng)且價(jià)格較貴的電泳檢測(cè)的步驟，實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)的自動(dòng)化，其檢出率也有大幅度的提高。此外，SNP通常由一對(duì)等位基因組成，又稱二等位基因標(biāo)記[10]，特點(diǎn)為在分析時(shí)只需對(duì)二等位基因即+/-進(jìn)行分析，省略了對(duì)基因片段長(zhǎng)度的分析，從而使得SNP標(biāo)記更易于實(shí)現(xiàn)檢測(cè)的自動(dòng)化[11]。

1.3 具有較高的穩(wěn)定性

SNP多發(fā)生在堿基C和T之間，且兩者比例為1:2。在生物基因組中，CpG二核苷酸的胞嘧啶極易自發(fā)的脫去氨基從而形成胸腺嘧啶，這一過程也被稱為甲基化[12]，在生物基因組中發(fā)生率較高。與串聯(lián)重復(fù)微衛(wèi)星等標(biāo)記相比，SNP標(biāo)記由2個(gè)、3個(gè)或4個(gè)等位基因構(gòu)成，但實(shí)際后兩種情況出現(xiàn)的幾率很小，常常被忽略[13]。相比于其他分子標(biāo)記，SNP標(biāo)記為單核苷酸的突變，且突變頻率很低，與一些不良性狀也不存在連鎖遺傳，因此屬于可遺傳的變異，遺傳穩(wěn)定性高。

1.4 代表性強(qiáng)

位于基因組內(nèi)部的某些SNP位點(diǎn)可能會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和表達(dá)水平產(chǎn)生直接的影響。因而或許會(huì)代表著疾病遺傳中的一些作用因素。

2 SNP的檢測(cè)方法

開發(fā)和利用SNP首先得檢測(cè)到和發(fā)現(xiàn)SNP。目前，SNP的檢測(cè)方法已比較完善，本研究就DNA構(gòu)象法、高分辨溶解曲線和直接測(cè)序法進(jìn)行概括。

2.1 DNA構(gòu)象法

目前，根據(jù)DNA構(gòu)象檢測(cè)SNP的方法主要有：（1）變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)，該法的優(yōu)點(diǎn)為檢出率高，即使只有一個(gè)堿基的改變也會(huì)被檢測(cè)出，但其變性條件的優(yōu)化和電泳時(shí)間需耗費(fèi)大量時(shí)間和人力，且需要特殊的設(shè)備和昂貴的試劑，成本高；（2）變性高效液相色譜技術(shù)(denaturing high performance liquid chromatogra phy，DHPLC)，該方法具有很高的靈敏度。通常，熒光測(cè)序只能對(duì)頻率在10%以上的SNP進(jìn)行檢測(cè)[14]。而DHPLC對(duì)頻率5%以下的SNP位點(diǎn)也非常有效；（3）單鏈構(gòu)象多態(tài)性(singlestrandconformation polymorphism，SSCP)，該法有適用面廣，操作簡(jiǎn)單方便且費(fèi)用低的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)150～450 bp的DNA片段進(jìn)行SNP檢測(cè)時(shí)，其檢出率可達(dá)90%。但許多因素都會(huì)影響SSCP檢測(cè)的靈敏度，穩(wěn)定性不高。

2.2 高分辨溶解曲線(HRM)法

HRM是由Idaho科技公司和猶他大學(xué)共同開發(fā)的一種檢測(cè)SNP位點(diǎn)的新手段，目前，HRM在檢測(cè)方法方面的不斷更新進(jìn)步，使其已經(jīng)成為檢測(cè)SNP位點(diǎn)的一項(xiàng)應(yīng)用較廣泛的技術(shù)。其原理為，當(dāng)核苷酸的性質(zhì)發(fā)生改變，DNA雙鏈熔解曲線也會(huì)有相應(yīng)的改變，具體過程為將飽和熒光染料在PCR反應(yīng)時(shí)加入，待其嵌入到DNA雙鏈中，在DNA雙鏈解旋時(shí)，其上的熒光信號(hào)會(huì)被儀器收集，得到熔解曲線。若DNA序列中的堿基發(fā)生突變，熔解曲線形狀和Tm值也會(huì)發(fā)生相應(yīng)的改變，再利用相關(guān)軟件對(duì)其進(jìn)行分析[15]。在HRM的檢測(cè)過程中，熒光染料對(duì)檢測(cè)的精確性和分辨率有重要影響，SYT09和ResoLight作為比較先進(jìn)的熒光染料，與DNA有更好的結(jié)合能力，可避免解旋過程中的重排現(xiàn)象，更加準(zhǔn)確的體現(xiàn)出DNA的解旋情況，從而提高了檢測(cè)的特異性和靈敏度。

2.3 直接測(cè)序法

直接測(cè)序法是目前檢測(cè)SNP的最可靠直接的方法，其檢出率可高達(dá)100%。如taqman[16]、微測(cè)序(SNaPshot)[17]以及焦磷酸測(cè)序(Pyrosequencing)技術(shù)。此方法通過對(duì)不同樣本中的基因片段或同一基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比或重測(cè)序分析已定位的表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)及序列標(biāo)簽位點(diǎn)(STS)來檢測(cè)SNP。測(cè)序時(shí)可先將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物純化回收然后再將其連接到載體上，也可對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序。通過對(duì)檢測(cè)到的序列進(jìn)行比對(duì)可得到發(fā)生突變的SNP位點(diǎn)及其突變類型。目前，該方法在人類基因檢測(cè)中的應(yīng)用已比較成熟，為人類高密度SNP圖譜的建立奠定了基礎(chǔ)。

直接測(cè)序主要用于SNP位點(diǎn)的分型及檢測(cè)，雖然測(cè)序自動(dòng)化程度的提高帶來測(cè)序成本的降低，但目前直接測(cè)序法的檢測(cè)的費(fèi)用依然比較高，且其對(duì)雜合體不易分型，這導(dǎo)致直接測(cè)序法在SNP檢測(cè)中的應(yīng)用受到限制。雖然測(cè)序自動(dòng)化程度的提高帶來測(cè)序成本的降低，但當(dāng)前直接測(cè)序的成本還比較高，而且很難區(qū)分雜合子，這導(dǎo)致直接測(cè)序在SNP中的應(yīng)用受到限制。

3 SNP在小麥遺傳育種中的應(yīng)用

3.1 構(gòu)建高密度的遺傳連鎖圖

高密度遺傳連鎖圖的構(gòu)建有利于對(duì)基因進(jìn)行精細(xì)的定位，圖譜中標(biāo)記密度越大，其實(shí)效性也會(huì)越大，其不僅對(duì)小麥基因組分析和表型變異的研究有重要作用，也會(huì)給物種資源的鑒定帶來新的消息[18-19]。

在近幾年的遺傳圖譜的研究中，Colasuonno等[20]利用硬粒小麥的重組自交系構(gòu)建了包含467個(gè)DArT、5019個(gè)SNP、182個(gè)SSR標(biāo)記的遺傳連鎖圖譜，并定位了7個(gè)與色黃素含量有關(guān)的QTL；田在民等[21]以289個(gè)小麥群體為試驗(yàn)材料，構(gòu)建了覆蓋長(zhǎng)度為2749.2 cM，覆蓋范圍分布在小麥的19個(gè)連鎖群，且標(biāo)記之間平均遺傳距離為17.4 cM的遺傳連鎖圖譜；Allen等[22]對(duì)全世界內(nèi)的5個(gè)小麥群體的SNP位點(diǎn)進(jìn)行篩選，構(gòu)建了包括225001個(gè)標(biāo)記的遺傳連鎖圖譜；Maria等[23]以136個(gè)硬粒小麥品種的重組自交系為材料，得到9040個(gè)SNP標(biāo)記，構(gòu)建了覆蓋基因組長(zhǎng)度2879.3 cM的小麥遺傳連鎖圖譜；同時(shí)，檢測(cè)新手段DNA芯片技術(shù)的運(yùn)用也給檢測(cè)工作帶來許多便利，Raz等[24]對(duì)硬粒小麥和野生二粒小麥雜交構(gòu)建的140株RILs進(jìn)行90K iSelect SNP全基因組掃描，共發(fā)現(xiàn)14088個(gè)SNPs位點(diǎn)，14個(gè)連鎖群，構(gòu)建了全長(zhǎng)為2110 cM的遺傳圖譜；Stuart等[25]對(duì)384HT系列硬質(zhì)小麥群體進(jìn)行研究，構(gòu)建了包含1345個(gè)SNP標(biāo)記的復(fù)合遺傳圖譜，并發(fā)現(xiàn)了6個(gè)與胚芽鞘長(zhǎng)度有關(guān)的QTL。

3.2 分子標(biāo)記輔助選擇育種

作物目標(biāo)性狀相關(guān)的分子標(biāo)記的獲得可提高育種的可預(yù)測(cè)性和選擇性，從而在選育新品種時(shí)有更加客觀的判斷。與其他分子標(biāo)記相比，SNP標(biāo)記在數(shù)量和分布上都有明顯優(yōu)勢(shì)，這使其在標(biāo)記輔助選擇(MAS)育種中擁有更大的潛力[26]。

Liu等[27]利用高密度的90K和600K SNP檢測(cè)技術(shù)對(duì)小麥黑點(diǎn)病進(jìn)行研究，檢測(cè)到18個(gè)新的與黑點(diǎn)病相關(guān)位點(diǎn)，分布于小麥的14條染色體上；Tan等[28]通過對(duì)252個(gè)小麥品種抗幼蟲基因的研究，發(fā)現(xiàn)位于7A染色體上5’端的第142個(gè)SNP位點(diǎn)對(duì)幼蟲抵抗力有較顯著的影響；Lin等[29]以155個(gè)易提前發(fā)芽和抗提前發(fā)芽小麥品種的子一代為試驗(yàn)材料，利用同樣的方法研究小麥提前發(fā)芽和種子休眠有關(guān)的基因位點(diǎn)。結(jié)果檢測(cè)到位于4A染色體上的GBS109947和GBS212432位點(diǎn)分別與小麥提前發(fā)芽和種子休眠性狀密切相關(guān)；此外，Gao等[30]利用SNP標(biāo)記對(duì)小麥抗莖銹病基因進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)了10個(gè)與抗莖銹病基因Sr42有密切關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)；禹文龍等[31]利用90K SNP芯片對(duì)121個(gè)小麥品種鹽脅迫下小麥根鮮重、莖鮮重等6個(gè)性狀進(jìn)行研究，結(jié)果共檢測(cè)到與6個(gè)性狀相關(guān)的耐鹽QTL 47個(gè)。

3.3 全基因組關(guān)聯(lián)分析

全基因組關(guān)聯(lián)分析是通過利用表型性狀和基因本身或基因附近微小區(qū)域的分子標(biāo)記的關(guān)聯(lián)來實(shí)現(xiàn)基因的精細(xì)定位[32-33]。其所定位的QTL解析率較高，可提高M(jìn)AS選擇的目的性和準(zhǔn)確性，從而提高育種的效率[34]。

Sivakumar等[35]利用90K SNP芯片對(duì)287個(gè)小麥材料進(jìn)行全基因組掃描。檢測(cè)到1個(gè)與粒重有關(guān)的位點(diǎn)，位于6A染色體上；4個(gè)與苗穗數(shù)有關(guān)的位點(diǎn)，分別位于3B、5B、5A和6A染色體上；5個(gè)與成熟期有關(guān)的位點(diǎn)，位于2B、3B、4D、4B和6A染色體上；Liu等[36]對(duì)歐洲的232個(gè)小麥品種的抗條紋銹病進(jìn)行研究，利用SNP標(biāo)記技術(shù)對(duì)試驗(yàn)材料進(jìn)行全基因組掃描，共發(fā)現(xiàn)了82個(gè)與幼苗株銹病相關(guān)的位點(diǎn)；周秀文[37]以134個(gè)小麥群體為研究對(duì)象，設(shè)置苗期，成熟期兩個(gè)時(shí)期，3個(gè)氮濃度處理。通過基因與性狀間的關(guān)聯(lián)分析，得到與苗期氮效率相關(guān)的分子標(biāo)記2278個(gè)，與成熟期氮效率相關(guān)的標(biāo)記3051個(gè)；Jighly等[38]利用SNP和DarT標(biāo)記對(duì)200個(gè)小麥品種進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，檢測(cè)到與小麥抗條繡病相關(guān)位點(diǎn)41個(gè)。其中，與小麥成熟期抗條繡病有關(guān)位點(diǎn)位于3BS、3BL、5BL、6AL和7DS染色體上，與小麥幼期抗條繡病有關(guān)位點(diǎn)位于3AS、3AL、1AL、2AL和2BS染色體上；Chen[39]利用SNP標(biāo)記對(duì)205份小麥品種進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，得到271個(gè)與千粒重等特征相關(guān)的標(biāo)記。

3.4 在遺傳分析和物種進(jìn)化中的應(yīng)用

通過對(duì)小麥基因中存在的SNP進(jìn)行比較分析，可獲得栽培品種與野生祖先種或野生近緣種間基因組水平上的DNA多態(tài)性信息，從而有利于促進(jìn)群體結(jié)構(gòu)分類、遺傳多樣性的研究以及不同小麥群體分化特點(diǎn)的分析[40-42]。

Mangini等[43]利用SNP標(biāo)記對(duì)3種硬質(zhì)小麥San Pasquale、Grano Ricco和Dauno3和普通小麥的基因進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)San Pasquale和Dauno3小麥與地中海小麥的基因有很大的相似性，Grano Ricco小麥與意大利南部小麥基因存在相似性，但與San Pasquale和Dauno3小麥的基因有較大差異；Ren等[44]利用SNP標(biāo)記技術(shù)對(duì)世界各地的150個(gè)硬粒小麥的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性進(jìn)行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)材料的遺傳結(jié)構(gòu)受環(huán)境條件、育種方法、基因漂移以及人類活動(dòng)等因素的影響較大，來自于南北美洲、歐洲的試驗(yàn)品種的遺傳基礎(chǔ)較寬，遺傳多樣性高；曹延杰等[45]利用90K SNP技術(shù)對(duì)96個(gè)試驗(yàn)品種的基因進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)品種間親緣關(guān)系較近，遺傳相似系數(shù)處于0.652～0.872之間，并可將其劃分為7個(gè)類群。劉進(jìn)英等[46]對(duì)9份不同休眠特性的小麥種子TaGAMy-B基因的全長(zhǎng)序列進(jìn)行測(cè)定，將拼接得到的全長(zhǎng)序列與已知TaGAMy-B基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，得到兩個(gè)新的等位變異基因，將其命名為TaGAMb-Ba和TaGAMyb-Bb。

4 展望

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，SNP標(biāo)記作為新興的第三代分子標(biāo)記以其位點(diǎn)多分布廣、穩(wěn)定性高加上代表性強(qiáng)的特點(diǎn)彌補(bǔ)了第一代和第二代分子標(biāo)記的缺陷，同時(shí)，第三代分子測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用及SNPs分析和檢測(cè)技術(shù)的不斷完善，特別是與DNA微陣列和芯片技術(shù)的結(jié)合，使得實(shí)驗(yàn)結(jié)果更為可靠。為了使SNP標(biāo)記技術(shù)更好的應(yīng)用于作物育種，應(yīng)該繼續(xù)推進(jìn)SNP標(biāo)記的研究：（1）為加強(qiáng)檢測(cè)的準(zhǔn)確性和快速性，未來將開發(fā)出不同作物的高通量SNP芯片，更多的SNP也會(huì)被發(fā)掘出并通過數(shù)據(jù)庫(kù)在全球范圍內(nèi)進(jìn)行共享。對(duì)作物SNP的研究將會(huì)從過去的低通量化、針對(duì)個(gè)別基因向高通量化、全基因組發(fā)展。（2）SNP分子標(biāo)記技術(shù)在小麥遺傳育種中的應(yīng)用已比較廣泛，利用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)小麥農(nóng)藝性狀進(jìn)行研究，可在早期通過標(biāo)記篩選優(yōu)良性狀基因，從而實(shí)現(xiàn)縮短育種年限、增加作物產(chǎn)量等目標(biāo)。（3）盡管當(dāng)前小麥作物SNP標(biāo)記技術(shù)的研究已有一定的進(jìn)展，但對(duì)小麥類產(chǎn)品如饅頭、面條等感官性狀（如白度、咀嚼性與彈性等）的研究還未見報(bào)道。鑒于面制品在中國(guó)消費(fèi)量巨大，可利用SNP標(biāo)記技術(shù)和基因工程技術(shù)，將多個(gè)優(yōu)質(zhì)感官性狀基因聚合到一個(gè)小麥新品種上，培育具有良好面制品特性的小麥新品種。