常見癌痛動物模型的優缺點及在中醫藥中的應用*

張 震 稅會利 陳志平 王鏡輝 黃雯琪 楊 兵 楊 柱 唐東昕

（貴州中醫藥大學第一附屬醫院腫瘤科，貴陽 550002）

癌性疼痛在許多腫瘤病人中普遍存在，目前對于癌性疼痛的治療依然以西醫的癌痛三階梯止痛原則為主[1]，其他治療方法包括手術、放化療等，但是西醫的各種治療方法不良反應較大，在治療的同時也讓病人痛苦不堪，近年來中醫藥在臨床癌性疼痛的治療中效果顯著，目前研究顯示，中醫藥治療癌痛療效確切，可顯著改善病人癥狀，提高病人生活質量，且不良反應少。對于癌痛研究的關鍵是各種模型的建立，相應的動物模型是研究癌痛的基礎。建立可靠的癌痛動物模型，將有利于研究癌性疼痛的基本作用機制，對開發治療癌性疼痛的藥物和方法具有重要意義。各種癌痛模型的建立也經過了漫長的探索與不斷地革新，本文對目前常見的癌痛動物模型的造模方法、優缺點進行論述，希望為癌性疼痛的研究提供造模參考。同時對各種癌痛模型在中醫藥中的應用進行論述，為進一步開展中醫藥治療癌性疼痛的機制研究奠定基礎。

一、骨癌痛模型的發展

骨癌痛在癌痛中疼痛十分劇烈而且很難有效止痛。所以對骨癌痛研究最關鍵的是骨癌痛模型的建立。世界上第一個小鼠股骨癌痛模型于1999年被美國的Schiwei成功建立，隨后其它部位的骨癌痛動物模型大量出現[2]。2002年Medhurst等成功構建脛骨癌痛模型[3]。現代研究發現，脛骨骨癌痛模型可視為轉移性骨癌痛模型，因為脛骨骨癌痛動物表現出來的疼痛和臨床的轉移性骨癌痛表現相似。同時該模型疼痛檢測方法簡單，易于操作，是目前十分理想的研究骨癌痛動物模型。

二、脛骨骨癌痛模型的制備

目前對于脛骨癌痛模型的建立，癌細胞常選取Walker256乳腺癌細胞，動物選取普通雌性Wistar大鼠，將Walker256乳腺癌細胞注射到大鼠腹腔進行細胞培養，收集大鼠腹水，離心收集細胞[4]。參照Medhurst[3]等的方法建立模型。首先對大鼠進行腹腔注射麻醉。大鼠達到麻醉標準后，將其仰臥位固定于操作臺上。將大鼠左側小腿脛骨部位剃毛、消毒。切開脛骨下段小心暴露脛骨骨面。用直徑為1 mm不銹鋼轉頭進行打孔，但要防止打穿。然后用微量注射器將含有大鼠Walker256乳腺癌細胞的腹水注入骨髓腔，注射后迅速用骨蠟封閉鉆孔處，用75%乙醇消毒傷口，傷口進行逐層縫合。整個操作嚴格遵守無菌操作。

關于骨癌痛模型的疼痛行為的檢測方法[5～8]包括機械性痛覺過敏(randall-selitto test)，自發疼痛行為學改變、熱痛覺過敏、機械性異常性疼痛(von Frey)。通過上述方法可對骨癌痛模型進行檢測。

三、脛骨骨癌痛模型的優點和其注意事項及不足之處

目前脛骨骨癌痛模型所選擇的細胞多來自自體接種大鼠產生的腹水瘤細胞，其來源相同，可直接進行腹腔注射。目前已經廣泛用于各種動物模型的建立[9]。目前應用廣泛的為Walker256細胞，其具有比較強的骨侵襲能力；而且細胞活力強，可在大鼠腹腔內大量增殖。對于手術方法也有改變，以往所采用的是脛骨平臺入路，手術中對大鼠脛骨組織分離的程度很難把握，因此對術后的觀察指標會造成很大的干擾。目前更多的采用脛骨中下段鉆孔注入腹水瘤細胞，中下段脛骨皮膚較薄，無肌肉覆蓋，很容易暴露骨頭，創面小出血少，完成后為避免細胞外溢需要用骨蠟快速封閉創口。也可以選擇用注射器針頭進行鉆孔，將10 μl注射器的針頭彎成120。～150。讓針尖盡可能多地進入骨髓腔，接種細胞后用骨蠟快速封閉鉆孔處。骨癌痛模型的制備不足之處在于前期的細胞培養為體內培養，而不是通過培養基進行培養，其培養成本較高，培養周期較長。培養細胞使用的大鼠一般要選擇離乳的幼鼠為最佳，周齡和體重過大對于細胞的培養會產生一定的影響。選擇注射的腹水瘤細胞盡量避免選擇含有血性腹水的細胞，大量研究表明血性腹水的細胞注射到骨髓腔內后，大鼠死亡率較高[10]。此外造模時需要制備者有一定的外科水平，對骨的解剖結構和骨科手術有一定的臨床經驗，初學者以及沒有外科基礎者需要反復進行實驗才能熟練掌握。有文獻表明骨癌痛模型大鼠在造模后28天左右多死于惡液質[10]。因此對于一些口服中藥止痛的觀察可能會因為灌胃周期較短而不能有效觀察中藥的止痛效果及中藥制劑治療癌性疼痛的機制。此外脛骨骨癌痛模型并不能代表所有骨癌痛，其它部位的骨癌痛模型也需要進一步的研究探索。

四、骨癌痛模型在中醫藥的廣泛應用

中醫藥在治療骨癌痛方面具有獨特的優勢，其方法多樣，副作用小，作用持久，臨床應用廣泛。但是對于中藥治療癌痛的作用機制研究較少。王玉等[11]在成功建立骨癌痛動物模型基礎上，研究乳腺癌術后骨轉方對癌痛大鼠疼痛行為及脊髓星形膠質細胞的影響，結果表明乳腺癌術后骨轉方的鎮痛機制可能是通過抑制脊髓水平星形膠質細胞GFAP、SP、CGRP的表達發揮止痛作用。付桃芳等[12]在成功建立骨癌痛動物模型基礎上，對模型大鼠連續腹腔注射嗎啡治療，11天后成功建立癌痛大鼠嗎啡耐受模型。通過觀察嗎啡治療前后應用電針治療骨癌痛的效果，研究發現電針治療可以延長癌痛大鼠嗎啡耐受形成的時間，對于已經產生耐受的骨癌痛大鼠，電針治療可以部分逆轉耐受，恢復嗎啡對骨癌痛大鼠的治療效果。骨癌痛動物模型的建立對于中醫藥在骨癌痛治療的機制和新藥的研究提供了良好的研究工具。

五、化療痛模型的優缺點及應用

化療藥物誘導的神經病理性疼痛，簡稱化療痛[13]。其疼痛機制和藥物的神經毒性有關。其化療痛動物模型的建立方法通常是將化療藥物注射到動物體內，使之產生痛覺過敏反應。化療痛模型的制備和骨癌痛模型相比，其制備方法簡單可行，而且制備經濟成本低。不需要進行細胞培養。而且化療痛模型一般形成的機械或熱痛覺過敏十分穩定，對于化療痛的機制研究和抗癌痛藥物的篩選具有重要的意義。但是通過各種化療藥物構建的化療痛癌痛模型也存在一定的不足之處。如通過長春新堿構建的癌痛模型產生的痛覺過敏和痛覺異常和劑量有關，而且如果持續腹腔注射長春新堿會導致模型老鼠運動功能障礙和較高的死亡率，因此該模型的應用在一定程度上受到了限制。而且隨著各種新型化療藥物的研發和應用。新型化療藥物癌痛模型的構建仍需深入的研究。目前的化療痛模型大多是神經病理性疼痛模型，化療引起的內臟痛和骨痛動物模型至今尚未成功構建。

目前，化療痛的機制尚不明確，國內外均尚未發現有效的藥物和方法能預防或控制這一并發癥。因此化療痛的發病機制以及治療化療痛的新藥開發是目前該領域的研究熱點。目前化療痛動物模型已經廣泛應用于研究治療化療痛藥物的篩選及藥物治療化療痛的分子機制當中。中醫藥在臨床中廣泛應用于治療化療引起的癌性疼痛。其療效確切，可以達到增效減毒的作用。眭明紅等[14]通過腹腔注射紫杉醇制備紫杉醇誘導的化療機械痛模型，通過該模型觀察電針“足三里”對紫杉醇誘導的化療機械痛小鼠痛閾的影響及持續時間，探討其鎮痛機制。觀察結果表明電針能有效抑制紫杉醇誘導的化療所致周圍神經痛，其鎮痛機制可能與降低血液促炎細胞因子有關。鐘敏鈺等[15]通過對成年雄性SD大鼠腹腔注射紫杉醇成功制備大鼠神經病理性疼痛模型，通過該模型觀察川芎嗪和普瑞巴林對大鼠疼痛的治療效果以及探討其止痛機制，研究結果表明川芎嗪和普瑞巴林對該化療痛模型老鼠具有止痛效果，二者療效相似而且聯合用藥具有協同增效的作用，其作用機制可能是通過降低神經系統中神經生長因子的表達來減輕神經損傷，達到止痛的效果。建立適合的化療痛動物模型為中醫藥在化療痛的發病機制和新藥的研究提供了良好的研究工具。

六、皮膚癌癌痛模型的優缺點及應用

皮膚癌死亡的主要原因之一是惡性黑色素瘤，絕大多數病人在確診時已進展到晚期,因此死亡率極高[16]。雖然疼痛不是臨床上黑色素瘤的主要癥狀，但仍有7%的病人出現疼痛。此外，轉移性黑色素瘤與疼痛有關（在某些情況下是神經性疼痛），超過50%的病人需要姑息治療和嗎啡治療。因此對于皮膚癌的研究和治療刻不容緩。此外，接種腫瘤細胞到后肢足底的動物表現出明顯的痛覺過敏[17]。因此可以在后肢足底皮下注射腫瘤細胞構建皮膚癌癌痛模型。通過在動物后肢足底皮下注射瘤細胞構建的癌痛模型較骨癌痛模型方法操作簡單易行，成瘤率高。對于疼痛的檢測方法也較骨癌痛模型簡單，只需通過熱、機械性痛覺過敏進行檢測，無需病理X線片檢測。但是皮膚癌癌痛模型仍存在一定的不足之處，目前皮膚癌癌痛模型選擇的部位大多數局限于四肢部位的皮膚，其余部位的皮膚癌癌痛模型目前尚未成功構建。同時對于足趾部的癌痛模型有文獻表明皮下注射瘤細胞14 d后足趾部位出現破潰、出血，因此此種癌痛模型無法對口服中藥制劑的止痛療效和作用機制進行研究[18]。常用于對注射用止痛藥物的療效檢測及機制研究。

近年來足跖皮膚癌是繼骨癌痛和化療痛模型之后，建立的一種新的癌痛模型。目前雖然皮膚癌癌痛模型的種類較少，但是皮膚癌癌痛模型得成功建立為研究探索皮膚癌癌痛的機制和新型治療藥物提供了一個很好的平臺。謝榮等[19]通過將腫瘤細胞經皮下注射到小鼠左后爪跖面，小鼠表現出疼痛行為學的改變，成功建立足趾皮膚腫瘤模型。通過該模型研究鞘內注射阿米洛利，檢測其對小鼠疼痛行為學的影響以及脊髓背角中ASIC-3蛋白表達。通過鞘內注射阿米洛利給藥后，觀察發現阿米洛利可提高癌性疼痛引起的小鼠熱痛閾值，減輕小鼠熱痛覺過敏行為反應，同時可以抑制小鼠脊髓背角ASIC-3通道蛋白的表達。該研究結果為臨床治療皮膚癌引起的疼痛提供了新的思路。Tabata等[20]通過在小鼠后肢皮下注射黑色素瘤細胞成功構建黑色素瘤皮膚動物模型。通過該動物模型觀察TrkA的抑制肽對腫瘤誘導的小鼠黑色素瘤疼痛模型產生的影響，研究結果表明，TrkA受體抑制肽通過減少小鼠皮膚癌疼痛模型中足爪體積的增加，從而明顯減輕黑色素瘤引起的疼痛。

七、其它癌痛模型的優缺點及應用

目前臨床上出現的神經性癌痛也很普遍。對于神經性癌痛動物模型目前研究較為廣泛的是通過腫瘤壓迫坐骨神經成功建立的神經性癌痛模型[21]。張文學等[22]將S180肉瘤細胞接種在坐骨神經肌肉叢中，然后觀察小鼠的疼痛行為學改變，成功建立小鼠坐骨神經癌痛模型。評價神經痛的普遍檢測方法包括自發性行為學評分、熱痛覺過敏和機械刺激等[23]。將腫瘤細胞接種在坐骨神經周圍的肌肉中該造模方法較骨癌痛模型操作方法簡單，成本低，周期短，成模后模型穩定，可重復性好。而且該模型與癌癥病人腫瘤壓迫坐骨神經產生的疼痛高度相似，可廣泛用于癌性疼痛的治療和疼痛機制的研究。

但是其它部位的神經痛動物模型目前還很少，如胰腺癌神經痛動物模型。經查閱大量文獻，發現一篇關于胰腺癌癌痛模型的研究，現作一簡要總結。Wang等[24]將胰腺癌細胞系SW 1990細胞移植到雌性BALB/c裸鼠胰腺上，在本研究中，小鼠胰腺癌所致疼痛模型引起小鼠明顯的駝背行為和肌肉過敏反應。通過測量腹部皮膚的機械閾值檢查來觀察疼痛的行為反應。通過該模型對脊髓背角與疼痛相關的10個特異性基因進行了相關研究。

大多數口腔癌是口腔黏膜上皮細胞產生的鱗狀細胞癌。口腔癌疼痛嚴重影響病人的生活，以往的研究很少報道以鱗狀細胞癌為動物模型研究癌性疼痛產生的分子機制。最近katsunori等[25]將鱗癌細胞(scc-158)接種于雄性Fisher大鼠牙齦造成牙齦癌痛模型，根據該模型研究牙齦癌痛產生的病理機制，采用藥理和免疫組織化學方法研究TRPV1、TRPV2在三叉神經節神經元和星型膠質細胞中表達結果，研究結果表明，TRPV1、TRPV2上調三叉神經節神經元可能在誘導的機械性痛覺過敏中起著重要的作用，此外星型膠質細胞的活化可能參與痛覺的形成。這將成為口腔癌疼痛治療的新靶點。

八、結語

目前對于癌痛的治療仍不理想，其病理機制仍不明確。近年來臨床應用中醫藥治療癌痛的研究越來越廣泛。雖然中醫藥的止痛療效十分顯著，但是其作用機制卻并不明確。各種癌性疼痛動物模型的成功建立為研究癌性疼痛的病理機制和中醫藥的作用機制提供了良好的平臺和理論依據。但是癌性疼痛的種類繁多，目前建立的癌痛動物模型并不能滿足所有的癌性疼痛的研究，如食管癌、肺癌等腫瘤引起的內臟痛模型很少有研究。同時在各種造模前可對動物的基礎痛閾值進行檢測，以排除動物自身基礎痛閾值偏高或偏低引起后期檢測的干擾，使癌痛模型更加科學、合理、規范。因此對于癌性疼痛動物模型的研究依然刻不容緩，相信隨著科技的進步和對癌性疼痛的不斷深入研究，在未來更多的理想的癌痛動物模型將會被成功建立，我們希望將來更多療效確切的中醫藥治療癌痛的方法能夠通過各種癌痛模型來證實其功效并深入研究其作用機制，加快中醫藥治療癌痛的研究與推廣。