疼痛性別差異的表觀遺傳學研究進展*

薛艷芝 魯顯福 胡嘯玲△ 王佑陵

（1南華大學附屬第一醫院麻醉科，衡陽 421001；2安徽醫科大學附屬第一醫院高新院區麻醉科，合肥 230031）

疼痛一直以來都是困擾人類的難題，機制尚不完全清楚，現有的治療方法還不能有效解決這個復雜臨床問題。人類的流行病學調查表明女性與男性疼痛相比患病率更高、疼痛更甚且持續時間更長，包括偏頭痛、腸易激綜合征、纖維肌痛、復雜性區域疼痛綜合征、風濕痛、顳下頜關節紊亂和盆腔痛等[1,2]。性別差異是個體化醫療的一部分，這意味著在兩性中，疾病治療的最佳療法可能會有所不同。既往認為存在性別差異的生物學機制包括性激素水平、性染色體、內源性鎮痛系統（μ/κ-阿片受體等）、免疫、疼痛相關的受體及遞質（如配體門控離子通道型嘌呤受體(ATP-gated ion channels purinergic receptors,P2XR)以及大腦結構和功能等生物因素以及抑郁焦慮等精神疾病和女性社會功能角色的特殊性等社會心理因素[3,4]。而最新研究發現，表觀遺傳機制可以在分子水平調節疼痛反應，參與疼痛發展的性別差異。表觀遺傳學調控證明了環境和生活方式對機體生物過程的影響，包括X染色體失活、DNA甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA (non-coding RNA,ncRNA)的表達等。目前，人類疼痛性別差異表觀遺傳學的科學尚處于早期階段。本文綜述疼痛中存在性別差異的表觀遺傳修飾的最新進展，這些發現對治療疼痛具有積極意義，它更好地闡明疼痛機制，利于其靶向治療。本文創新之處為，以性別差異為出發點，從X染色體失活、DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA表達等領域較全面地探討疼痛差異的表觀遺傳學機制，有望為研究疼痛機制及其靶向治療開辟一條新的途徑。

一、表觀遺傳學現象

表觀遺傳是指不改變實際DNA序列，基因表達發生改變且可以遺傳。它們是環境因素與細胞內遺傳物質之間發生交互作用產生，可以影響生理和病理過程[5]。表觀遺傳修飾包括X染色體失活、DNA甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA的表達等。

雌性哺乳動物含有XX染色體，而雄性則含有XY染色體，為了保持性染色體連鎖基因表達劑量的平衡（劑量補償），就有了X染色體失活(X-chromosome inactivation,XCI)。它是通過對雌性的一條X染色體隨機失活的方式對X連鎖的基因表達進行調控來實現的。目前對X失活機制的研究表明，它并不是隨機的，而是X染色體上的失活中心(X-chromsome inactivation center,XIC)通過表達的長鏈非編碼RNA對所在染色體進行順式調控，有關X染色體失活機理可能是引起疾病、衰老以及性別差異的原因[6,7]。

DNA甲基化主要是共價修飾胞嘧啶殘基，主要作用位點為胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤(CpG)二核苷酸的胞嘧啶。CpG位點分布在整個DNA序列中，包括啟動子、基因體和轉座因子的組織特異性功能的差異甲基化區域(differentially methylated region,DMR)[8]。基因調控序列（如啟動子或增強子）上DNA甲基化可以抑制基因表達。這種抑制是由一個甲基群識別蛋白系統完成的，該系統招募特定的編程因子來生成一個封閉的染色質結構，從而使轉錄機制難以訪問該基因，使基因表達降低。

在細胞核中，大多數基因組DNA是由H2A、H2B、H3和H4各兩分子組成的組蛋白八聚體周圍緊密壓實，通過接頭H1組蛋白加連接體DNA連接成核小體。該結構維持基因組的穩定性并防止其他核蛋白質進入基因組DNA。在活細胞中，核小體通過核蛋白與核心組蛋白的N末端尾部內的特定殘基的翻譯后修飾(posttranslational modification,PTM)進行動態重構，涉及乙酰化、甲基化、磷酸化和泛素化等。通常，組蛋白乙酰化和磷酸化增加轉錄，而組蛋白甲基化可以沉默或增加基因表達[9,10]。

ncRNA是不編碼蛋白質的RNA。它們根據其大小和功能進行分類，主要成員包括微核糖核酸(microRNA,miRNA)和長鏈非編碼核糖核酸(long ncRNA,lncRNA)。miRNAs含有20～24個核苷酸，轉錄后通過mRNA降解或抑制翻譯來抑制蛋白質表達。miRNAs是很小（21～23個核苷酸）的單鏈RNA分子。 miRNA不被翻譯成蛋白質但具有調節功能。 miRNAs形成RNA誘導的沉默復合物，其可以通過激活降解mRNAs的內切核酸酶或通過阻斷翻譯來阻止蛋白質的表達[11]。miRNA與細胞分裂和死亡、細胞代謝、細胞內信號傳導、免疫和細胞運動等生理過程相關。因此，miRNA表達改變可影響這些關鍵過程，并因此導致各種病理性的不良結果。lncRNAs長于200個核苷酸，可通過與DNA、RNA或蛋白質相互作用干擾轉錄和轉錄后過程。

二、疼痛性別差異的表觀遺傳學

1.X染色體失活

女性中兩條基本相同的X染色體之一上約一千個基因的失活是眾所周知的表觀遺傳學基因沉默機制之一。在人類中，約15%的X連鎖基因從XCI中逃逸。逃逸基因存在個體差異和組織特異性。因此，從XCI逃逸不僅會導致男性和女性之間的表達差異，而且會導致女性之間的組織表達差異。這可能對男女之間或女性之間的疾病差異具有重要意義。XCI與其他表觀遺傳學機制存在密切的互交聯系[12]。組蛋白去甲基酶kdm6a是XCI中逃逸基因所編碼的酶， Kdm6a以去甲基酶酶活性依賴性方式通過在啟動子處使組蛋白H3賴氨酸第27位三甲基化(tri-methylation at lysine 27 of histone H3,H3K27me3)去甲基化來促進白細胞介素-6 (interleukin-6,IL-6)表達。Kdm6a也促進β干擾素(interferon-beta,IFN-β)表達。IL-6是重要的細胞因子，參與炎癥以及免疫應答及調節。IFN-β參與抗病毒及免疫調節。逃逸基因性別差異導致其所編碼的kdm6a表達發生改變，其在雌性中的表達水平高于雄性[13]。這些研究便于我們更好地理解在炎癥和自身免疫疾病（如類風濕性關節炎，多發性硬化癥，復雜性區域疼痛綜合征等）疼痛中存在的性別差異。

2.DNA甲基化

瞬時受體電位錨蛋白1 (transient receptor potential anchoring protein 1,TRPA1)是一種重要的轉導分子，在傷害性感覺神經元中的表達可調控疼痛敏感性。單基因雙胞胎的全基因組甲基化分析發現TRPA1啟動子中CpG二核苷酸的甲基化與熱誘發疼痛的閾值呈負相關[14]。TRPA1介導感覺傳入神經的機械敏感性和壓力誘發的疼痛。分析了75名健康志愿者的全血樣品中的TRPA1基因啟動子區域中47個CpG位點的甲基化狀態，發現影響熱誘發疼痛閾值的CpG位點在壓力疼痛閾值較低的受試者中是超甲基化的，并且還存在性別差異，女性與男性相比，甲基化率更高，壓力疼痛敏感性也更高[15]。

纖維肌痛 (fibromyalgia,FM) 以慢性廣泛疼痛、疲勞和認知/情緒障礙為特征，女性多見。研究發現女性纖維肌痛病人與差異性甲基化相關，這些相關的甲基化位點包括腦源性神經營養因子 (brain-derived neurotrophic factor,BDNF)、N-乙酰基轉移酶15 (N-acetyltransferase15,NAT15)、組蛋白去乙酰化酶 4 (histone deacetylase4,HDAC4)、蛋白激酶 C-α(protein kinase C,alpha,PRKCA)、漿膜蛋白1 (reticulon1,RTN1) 和cGMP依賴性蛋白激酶1 (cGMP-dependent protein kinase 1,PRKG1)[16]。

3.組蛋白修飾

組蛋白修飾在表觀遺傳調控中起著重要的作用。組蛋白甲基轉移酶G9a，又稱為常染色質組蛋白賴氨酸N-甲基轉移酶2 (euchromatic histone lysine N-methyltransferase 2,Ehmt2)，由Ehmt2基因編碼，是常染色質主要的甲基轉移酶之一，可以甲基化組蛋白H3賴氨酸第9位(histone 3 lysine 9,H3K9)、組蛋白H3賴氨酸第9位(histone 3 lysine 27,H3K27)和組蛋白H1b賴氨酸第26位(histone 1b lysine 26,H1bK26)等。此外，G9a也可以直接甲基化一些非組蛋白，并與DNA甲基化密切相關。G9a功能紊亂可以導致疼痛的發生發展[17]。慢性疼痛時，G9a是抑制基因轉錄重要的表觀遺傳標志蛋白。甲基化CpG結合蛋白2 (methyl-CpG-binding protein 2,MeCP2)是一種轉錄阻遏蛋白，MeCP2通過與DNA中的甲基-CpG位點結合，募集G9a等轉錄因子形成復合體，來抑制特定基因的轉錄[18]。周圍神經損傷后4周小鼠背根神經節(dorsal root ganglia,DRG)中也發現MeCP2表達增加[19]。MeCP2在全腦再分布的變化也可直接或間接調節DRG中基因表達[20]。MeCP2會抑制轉錄抑制因子組蛋白二甲基轉移酶G9a，導致杏仁核中央核(central nucleus of the amygdala,CeA)中G9a催化的產物H3K9me2減少并且腦源性神經營養因子(BDNF)的表達增加。在CeA局部采用病毒載體介導的MeCP2過表達，環化重組酶(cyclization recombination enzyme,Cre)誘導的G9a敲低以及給予BDNF可以延長疼痛效應。敲除小鼠MeCP2后，小鼠CeA中G9a及H3K9me2表達水平升高，痛閾升高。這些表明，在杏仁核MeCP2直接抑制G9a，可以調節對疼痛和阿片類藥物獎賞的情緒反應[21]。MeCP2突變亦導致Rett綜合征，這是一種X染色體連鎖的嚴重的漸進性神經發育紊亂，女性多見，這些病人表現出傷害感受受損。重要的是，Kurian等發現雄性大鼠杏仁核、腹內側下丘腦(ventromedial hypothalamus,VMH) 內表達的MeCP2 mRNA和蛋白質明顯少于雌性[22]。此外，G9a還顯示甲基化編碼μ阿片受體(μ-opioid receptor,MOR)基因的啟動子，MOR被阿片樣物質如嗎啡激活。眾所周知，嗎啡耐受和鎮痛作用均存在明顯性別差異。 坐骨神經分支選擇性神經損傷(spared nerve injury,SNI)模型誘導的MOR基因和蛋白質的下調與MOR基因啟動子中高度富集的G9a產物組蛋白H3賴氨酸第9位二甲基化 (histone 3 lysine 9 dimethylation,H3K9me2) 相關。綜上所述，我們有理由相信MeCP2/G9a所調節的表觀遺傳學改變可能是引起疼痛并且造成性別差異的原因之一。

17β-雌二醇 (17β-estradiol,E2)可以增強切除卵巢大鼠的結直腸擴張刺激時的內臟運動反應(visceromotor response,VMR)，且是由雌激素受體(estrogen receptor alpha,ERα)介導的[23]。有研究發現組蛋白脫乙酰酶抑制劑(histone deacetylase inhibitor,HDACi)辛二酰苯胺異羥肟酸(suberoylanilide hydroxamic acid,SAHA)可以減弱E2產生的這種反應，且脊髓背角的代謝型谷氨酸受體2 (metabolic glutamate receptor2,mGluR2) mRNA和蛋白增加。SAHA增加H3K9ac和ERα與代謝型谷氨酸受體2啟動子區域的結合。反之，mGluR2 拮抗劑又可以逆轉了SAHA對E2所致大鼠VMR的減弱作用[24]。總之，脊髓中HDACi/mGluR2可能介導減弱E2內臟敏感性的促傷害作用。

過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator activated receptors,PPARs)是一類核激素轉錄因子，已成為臨床前研究中疼痛的重要調節因子，因此成為治療疼痛的重要靶點[11]。性激素調節PPARs的表達[25]。PPAR天然配體和合成激動劑具有抗炎作用。PPARα激動劑可以逆轉雄性小鼠SNI誘導的異常性疼痛，但不能逆轉雌性或閹割的雄性，而PPARγ激動劑可以逆轉雌性的異常性疼痛，而不會逆轉男性或睪丸激素治療的雌性[26]。Downing等[27]的研究發現，HDACi葡萄籽原花青素提取物增強組蛋白乙酰化作用，且PPARα基因和磷酸化蛋白表達增加，PPARα活性增加，HCACi/PPAR途徑可能是逆轉雄性異常疼痛的機制。

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome,IBS)是一種以腹痛為主要癥狀之一的疾病，有明顯的性別差異。 IBS的病因尚不清楚。表觀遺傳學認為懷孕期間母親的生活方式和環境因素會影響后代的健康，研究表明慢性產前應激(chronic prenatal stress,CPS)表觀遺傳上調了Sprague-Dawley大鼠雌性后代腰段脊髓背角而非背根神經節(dorsal root ganglia,DRG)上腦源性神經營養因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)的表達，這與雌性后代內臟過敏(visceral hypersensitivity,VHS)相關，但與雄性后代無關。成年后再次暴露于異源性慢性應激會使VHS在雌性中的持續時間長于雄性。慢性產前應激BDNF的上調可能與在雌性CPS大鼠的脊髓背角中的Bdnf啟動子IX的核心啟動子區域(-95/-26)處的RNA Pol II與組蛋白H3乙酰化的顯著增加以及組蛋白脫乙酰酶1明顯降低有關[28]。

父系的生活方式和環境因素也會影響后代。Vassoler等[29]研究結果明， 用可卡因處理的雄性小鼠作為父系時，乙酰化組蛋白H3與內側前額葉皮質(medial prefrontal cortex,mPFC)中BDNF啟動子結合，增強其乙酰化水平，在雄性后代中BDNFm-RNA增加并顯示出可卡因抗性表型，而雌性后代則不顯示可卡因抗性表型。表明mPFC中BDNF啟動子乙酰化與可卡因抗性相關，且成性二態。

4.非編碼RNA(ncRNA)

研究觀察到許多miRNA可以與X非活性特異性轉錄物(X inactive specific transcription,XIST)以及X染色體失活相關的長鏈非編碼RNA (long non-coding RNA,lncRNA)結合調控XCI。核轉錄因子Yin-Yang1 (YY1)是一種核轉錄因子，是miR-34a靶基因，具有多樣復雜的生物學功能。YY1因其名稱“陰陽”暗示，YY1可激活或抑制基因轉錄，具體取決于細胞所接受的刺激及其聯系與其他細胞因子。 YY1通過直接結合其靶啟動子并募集組蛋白和DNA修飾子來調節基因表達。炎癥反應時，不論是女性人神經母細胞瘤細胞(SH-SY5Y)還是雌性小鼠巨噬細胞(J774A.1)中miR-34a被下調，其不僅可以通過直接作用于XIST，使XIST表達增加，而且可以通過作用于YY1，先使YY1下調，間接使XIST表達增加。miR-34a/YY1/XIST可調節炎癥反應失調相關的疼痛如復雜區域疼痛綜合征(complex regional pain syndrome,CRPS)[30]。

車禍后頸椎損傷是頸椎軸性痛的常見病因，女性多見，表現為單側或雙側的頸項、后肩胛區的慢性鈍痛，可伴有頭暈、頸部僵直等。研究發現位于X染色體上的8個miRNA發生差異性表達，包括miR-532-5p，-501-5p，-500a-3p，-362-5p，-500b-5p，-502-3p，-20b-5p和let-7f-2-3p。X染色體這些miRNA在女性中的表達水平始終高于男性，可能與女性持續的嚴重軸性疼痛有關[31]。

免疫途徑參與疼痛性別差異。雌性小鼠通過淋巴細胞處理機械性疼痛，但當淋巴細胞不存在時可以使用小膠質細胞依賴性途徑[26]。脊髓背角小膠質細胞在雄性小鼠的疼痛超敏反應是必不可少，Toll樣受體4 (Toll-like receptors,TLR4)由小膠質細胞表達，許多研究表明TLR4是雄性小鼠機械性疼痛超敏反應（異常性疼痛）所必需的。給予神經病理性疼痛和炎性痛的兩性小鼠鞘內注射神經膠質抑制劑可以逆轉雄性小鼠的這種疼痛，但不能逆轉雌性小鼠[3,32]。此外，阻斷參與小膠質細胞-神經元疼痛通路的幾種信號傳導介質，特別是P2X4受體，p38 MAP激酶或腦源性神經營養因子，可以逆轉雄性的異常性疼痛[33]，但不能逆轉雌性小鼠異常性疼痛[26,32]。研究表明，TLR4是miR-451的直接靶點，miR-451可以通過靶向TLR4抑制小膠質細胞激活介導的炎癥來緩解雄性小鼠慢性炎癥疼痛[34]。在坐骨神經慢性壓迫性損傷(chronic constriction injury,CCI)后10天開始短期使用嗎啡，延長了CCI機械性異常性疼痛的持續時間。這種致敏作用依賴于小膠質細胞反應性和TLR4信號傳導，miR-124和miR-146a可以調節這種信號傳導，兩者均可以逆轉嗎啡誘導的持續致敏，并且在miRNA給藥結束的數小時至數天內再次出現異常性疼痛[35]。綜上所述，除了miR-451外，靶向TLR4的miRNA，抑制TLR4信號傳導，可能逆轉雄性的神經病理性疼痛。

NONRATT021972是一種lncRNA，參與傷害性信號傳導。Liu等[36]研究發現在2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)大鼠DRG中 lncRNA NONRATT021972、P2X7和 TNF-α表 達 增 加，且大鼠的機械性縮爪閾值(mechanical withdrawal threshold,MWT)、熱縮足潛伏期值(thermal withdrawal latency,TWL)和尾神經感覺神經傳導速度(sensory nerve conduction velocity,SNCV)均增加，抑制NONRATT021972下調P2X7和TNF-α表達。已經有研究發現關節內抑制P2X7可明顯減弱雌性大鼠膝關節滑膜炎的關節痛覺過敏和炎癥[37]。NONRATT021972/P2X7R途徑可能介導了疼痛的性別差異。

三、結語

在過去的20年或更長的時間里，人們意識到許多疾病在男性和女性中不同。雖然有大量關于疼痛性別差異的研究，但臨床影響仍然不足，臨床醫生對于疼痛的治療用藥依舊很少考慮性別差異因素。與此同時，人們發現生物醫學研究中的大多數實驗對象在臨床和臨床前研究中都是雄性，對雌性的研究是不夠的。這恰恰是由于實驗者的社會偏見，他們往往選擇雄性而不是雌性。在動物研究中，由于發情周期引起的變化，雌性被認為比雄性更易變。本文重要的是強調性別差異與疾病機制密切相關，研究者們更不應該漠視這種性別差異。綜上所述，疼痛性別差異的表觀遺傳學因素參與疼痛調節，進一步研究其對治療疼痛有積極的意義，值得研究者們予以更多關注。