白細胞內IRE1αlpha-XBP1信號通路控制前列腺素的生物合成進而參與對痛覺的調控

一、研究背景

內質網(ER)的功能是保證分泌蛋白和跨膜蛋白的正確折疊以及翻譯后修飾。而在多種生理或病理情況下會引起錯誤折疊蛋白在內質網內的堆積，繼而引起內質網應激并誘發未折疊蛋白反應(UPR)。IRE1αlpha-XBP1信號通路是UPR中進化最為保守的一個分支。當ER穩態發生改變時，雙酶IRE1αlpha經過寡聚化和自身磷酸化，進而激活其內切核糖核酸酶結構域，從未剪接的XBP1 mRNA中切除26個核苷酸片段，這種非常規剪接直接釋放出功能型轉錄因子XBP1，后者能夠促進多個具有控制內質網蛋白折疊能力基因的表達。大量證據表明IRE1αlpha-XBP1信號也可控制非UPR依賴的細胞內通路，進而影響肝內脂肪生產、低氧反應、血管生成、動脈粥樣硬化、關節炎以及抗腫瘤免疫等過程。通過質膜上的Toll樣受體(TLRs)，髓系白細胞選擇性地快速激活IRE1αlpha-XBP1通路，對產生適量的促炎細胞因子是很必要的。然而在炎癥狀態下，白細胞內由IRE1αlpha-XBP1通路調控的精準轉錄和代謝過程及其生理結果還很不清楚。

二、主要研究結果

1.IRE1αlpha通路控制髓系白細胞通過模式識別受體(PRR)而誘發的轉錄過程

為了研究IRE1αlpha-XBP1通路激活如何影響髓系白細胞內廣泛的基因表達，研究者們使用細菌脂多糖（LPS，TLR4激動劑）和真菌酵母多糖（Dectin-1和TLR2激動劑）刺激野生型(WT)以及IRE1αlpha缺陷的骨髓來源的樹突細胞(BMDCs)，并進行無偏好轉錄分析。結果與以前的報道一致，受到以上微生物產物刺激的WT-BMDCs出現了依賴IRE1αlpha的Xbp1剪接體，而不是在ER應激反應中應該出現的常規XBP1靶基因的強勁誘導表達或其他UPR分支的激活。用LPS 或酵母多糖刺激后，沒有出現IRE1αlpha依賴的調節性衰退(RIDD)跡象，因為已報道過的、在此過程中應該被調節表達的幾個基因并沒有在IRE1αlpha缺陷的BMDCs中出現明顯表達。盡管IRE1αlpha缺陷不影響粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)刺激下的BMDC繁殖與存活，但分別用LPS和酵母多糖刺激IRE1αlpha缺陷的BMDCs時，發現與WT-BMDCs比較分別有1792和2863個基因發生了顯著性表達改變，二者中有1167個基因相同，表明這1167個基因發生明顯表達改變的效應是不依賴特異激動劑、而是依賴IRE1αlpha缺陷的共同效應。經靈巧路徑分析(IPA)，可以把這1167個基因通過富集(Enrichment)分成九個生物類別。正如研究者所期望的，在IRE1αlpha缺陷影響其轉錄的靶基因中，有調控蛋白翻譯后修飾和維持細胞存活的基因。令研究者感到驚喜的發現是，在BMDCs受LPS或者酵母多糖刺激后，花生酸類物質的生物合成和代謝是受到IRE1αlpha調節的主要細胞功能。研究者們又進一步確定了27個調節因子，不僅其本身mRNA水平的表達有顯著改變，并且能夠調控大量的其他已知靶基因。同時證實了之前的報道，與WT-BMDCs相比，IRE1αlpha缺陷的 BMDCs在通過TLR刺激后，Il6及其相關靶基因的表達都出現顯著的下調。此外，Ptgs2/Cox-2和Ptges/mPGES-1作為潛在的類花生酸類物質代謝的調節因子，在LPS或酵母多糖刺激后的IRE1αlpha缺陷的BMDCs中出現了明顯下調，這與IPA分析結果所預示的相一致。研究者們也分別用RT-PCR和Western bolt實驗進一步證實，在受到刺激的、IRE1αlpha缺陷的BMDCs中，以上兩個調控因子在mRNA和蛋白水平均出現下調。但IRE1αlpha缺陷不影響組成型的Ptgs1/Cox-1或Ptges2/mPGES-2基因表達，表明這種內質網應激感受器的主要功能是介導Ptgs2/Cox-2和Ptges/mPGES-1的快速誘導表達。綜合以上實驗結果，研究者們認為IRE1αlpha是髓系白細胞生成類花生酸類物質所必需的。

2.IRE1αlpha-XBP1信號為正常前列腺素生物合成所必需

前列腺素是類花生酸類物質中的主要成員之一，它的生物合成依賴于Cox-2對花生四烯酸的快速代謝。這種具有生物活性的脂類參與多種生理過程，如過敏反應、發熱、血管通透性和疼痛等。盡管脂質分析顯示IRE1αlpha缺陷不影響未受刺激的BMDCs分泌基礎水平的前列腺素，但與WT-BMDCs相比，IRE1αlpha缺陷的BMDCs在受LPS刺激后，細胞內的一些前列腺素如PGE1,PGF1a,PGD2,PGE2,PGF2a,15-keto PGF2a,D12-PGJ2,13,14dh-15k PGE2和 PGD3的水平出現顯著地持續下調，這與Cox-2的誘導生成受損相一致。

Cox-2可將花生四烯酸轉化為前列腺素內過氧化物H2(PGH2)，后者被mPGES-1進一步代謝成強效的脂質介質PGE2。與LPS刺激后IRE1αlpha缺陷的BMDCs內Cox-2和mPGES-1的生成減少相一致的是，與WT-BMDCs比較，RE1a缺陷的BMDCs內PGE2的生成也明顯減少。其他缺乏IRE1αlpha的髓系白細胞亞群，如初級中性粒細胞和巨噬細胞，在LPS刺激后也表現為PGE2合成缺陷。為進一步在體驗證以上發現，研究者們對白細胞內IRE1αlpha選擇性缺陷的轉基因鼠(Ern1f/f Vav1cre)給予LPS腹腔注射，隨后用RT-PCR法原位定量分析PGE2的生成。LPS刺激可誘發腹膜白細胞內Xbp1的剪接以及后續依賴IRE1αlpha的Ptgs2和Ptges的生成。因此與WT組鼠相比，白細胞內缺乏IRE1αlpha鼠在LPS刺激后，腹膜來源的PGE2減少。通過一種獨立的激動劑來驗證前面轉錄組學的實驗結果，發現IRE1αlpha缺陷的BMDCs在酵母多糖刺激后，PGE2的合成也減少。類似的結果也在腹腔注射酵母多糖的白細胞IRE1αlpha缺陷的小鼠在體實驗中得到證實。脂質體分析進一步發現，與Ern1f/f鼠比較Ern1f/fVav1cre鼠的無細胞腹腔灌洗液中依賴Cox-2合成的前列腺素（PGE2，PGD2和 PGF2a）和TBX2明顯減少，與之成鮮明對照的是脂氧合酶依賴的15-HETE合成則未受到影響。XBP1缺陷與IRE1αlpha缺陷髓系白細胞的表型相同，而消融內質網其他應激感受器如PERK（Eif2ak3所編碼）和ATF6a，在LPS或酵母多糖刺激后，并未表現出PGE2的生成減少。因此白細胞選擇性的需要IRE1αlpha-XBP1通路以保證在受LPS或酵母多糖刺激時產生足量的PGE2。

用其他質膜結合的TLRs的激動劑處理BMDCs，也觀察到了IRE1αlpha依賴的PGE2誘導生成，但激活核內的TLR3,TLR8或TLR9均無此作用。以上結果與之前報道相一致，即IRE1αlpha-XBP1通路可以被質膜結合的TLRs激動劑顯著激活，而核內TLRs的激活并無此作用。用佛波酯(PMA)處理IRE1αlpha缺陷的BMDCs，其PGE2的生成也出現下調，此結果排除了IRE1αlpha缺陷導致TLR信號通路受損的可能性。此外，研究者還發現應用內質網應激激動劑—毒胡蘿卜素處理IRE1αlpha缺陷的BMDCs，其PGE2的生成也下調，與之相應的是Cox-2和mPGES-1表達的也下調。綜合以上實驗結果，小鼠髓細胞經內質網應激或刺激質膜結合的TLRs引起的PGE2適量合成需要IRE1αlpha-XBP1通路的激活，后者促進了Cox-2和mPGES-1的表達。

為進一步明確IRE1αlpha-XBP1通路是否能夠控制人髓系白細胞內PGE2的生成，實驗者從健康志愿者的外周血中取得單核細胞來源的樹突狀細胞(DCs)，并通過基因編輯技術敲除IRE1αlpha-XBP1通路。原代人DCs經瞬時轉染靶向XBP1的單導RNA (SgRNA)-Cas9復合體可有效地編輯該基因，并在酵母多糖處理后有效阻止了其活性轉錄形式的生成。與轉染了打亂sgRNA-Cas9復合體（對照）的WT-DCs相比較，酵母多糖處理XBP1缺陷 的人DCs后，PTGS2和PTGES的誘導生成以及PGE2的產生都明顯減少。類似的結果也在轉染了靶向ERN1復合體的人DCs中觀察到。以上實驗表明，誘導PGE2生成的、保守的IRE1αlpha-XBP1通路在人DCs得到證實。

3.XBP1s反式激活人PTGS2和PTGES啟動子

為了研究人白細胞中IRE1αlpha激活的XBP1(XBP1s)調控PGE2生成的分子機制，研究者分析了PTGS2和PTGES的啟動子區域，即XBP1s可能的結合位點，并在PTGS2啟動子上找到了前人所預測的X-box結合和未折疊蛋白反應元件A (UPRE-A)序列。此外，還在PTGES啟動子中識別出一個X-box結合區和兩個ETS結構域結合位點。所以，實驗者假設XBP1可能是PTGS2和PTGES的轉錄驅動因子。

為了研究結合于已識別啟動子區域的XBP1s，研究者運用了染色質免疫共沉淀(ChIP) -PCR技術。通過單獨用酵母多糖或者同時應用酵母多糖和2-脫氧-D-葡萄糖（2-DG，可抑制N-連接蛋白糖基化）刺激人單核細胞來源的DCs，產生內質網應激并強力激活IRE1αlpha-XBP1通路。酵母多糖刺激促進了XBP1s結合于PTGS2和PTGES預測的啟動子區域，若同時合用內質網應激激活劑2-DG刺激，可顯著增強以上結合效應。用抑制劑MKC8866選擇性失活IRE1αlpha的核糖核酸酶(RNase)結構域，則完全抑制了酵母多糖誘發的內質網應激的人DCs中的XBP1s與以上啟動子區域的結合。XBP1s也可結合在GFPT1的啟動子區域，然而缺乏XBP1結合位點的pri-miR-21的啟動子區域在本研究中沒有得到富集。此外，用人胚腎(HEK) 293細胞進行熒光素酶報告基因的實驗表明，XBP1s能劑量依賴性反式激活人PTGS2和PTGES啟動子。相反，PERK控制的ER應激轉錄因子CHOP在此報告系統中沒有受到影響。以上研究表明，IRE1αlpha激活的XBP1s通過直接驅動PTGS2和PTGES的轉錄誘導進而促進PGE2的生物合成。

4.白細胞內IRE1αlpha-XBP1通路促進疼痛行為

由Cox-2和mPGES-1誘導產生的PGE2與外周感覺神經元和中樞神經系統中的EP1-4受體結合后促進疼痛反應。研究者認為在白細胞內缺乏IRE1αlpha的小鼠，由于合成PGE2的功能受損，會減輕在炎性刺激下的疼痛行為。研究者采用了兩種經典PGE2依賴的疼痛模型：醋酸誘發的內臟痛模型和足底切口的術后疼痛模型。Ern1f/f和Ern1f/f Vav1cre鼠經腹腔注射0.9% (v/v)的乙酸后，雙盲監測實驗鼠的30分鐘內扭體行為發現，與Ern1f/f鼠比較IRE1αlpha缺陷的Ern1f/f Vav1cre鼠的扭體次數以及無細胞腹腔灌洗液中的PGE2水平均明顯降低。自動化的無偏向和雙盲實驗用來評估醋酸引起的炎性內臟痛如何影響實驗鼠的正常運動能力。與Ern1f/f Vav1cre鼠相比，Ern1f/f鼠的運動能力下降，表現為注射醋酸之后總體移動次數和運動時間減少。同時，白細胞缺陷XBP1鼠(Xbp1f/f Vav1cre)也出現扭體行為的減少，據此可以確認經典的IRE1αlpha-XBP1通路介導了此類痛反應。腹腔白細胞內組成型（與誘導型相對應）IRE1αlpha依賴的XBP1剪接體在給醋酸后維持上調，但在IRE1αlpha缺失的白細胞中，Ptges表達比正常時降低了約50%。在相同時間點進行比較分析，發現IL-1β，IL-6和TNF-α 的表達無論在mRNA水平還是蛋白水平均未發生明顯改變。表明在受醋酸刺激時，白細胞內部的IRE1αlpha可在不影響其他促炎因子合成分泌的情況下，能夠快速生成PGE2。IRE1αlpha介導的扭體反應在雌鼠和雄鼠的表現類似，表明性別對該表型無影響。研究者又分別使用IRE1αlpha的兩種抑制劑：激酶結構域特異性抑制劑KIRA6和核糖核酸酶結構域特異性抑制劑MKC8866，用藥理學方法抑制IRE1αlpha-XBP1通路觀察是否可以減輕炎性內臟痛。分別在腹腔注射醋酸前6 h和30 min進行腹腔給予KIRA6及MKC8866，實驗結果顯示兩種抑制劑均可以減少腹腔白細胞內的Xbp1s和Ptges表達，并且顯著減少實驗鼠的扭體次數。應用相似劑量的塞來考昔（Celecoxib，一種通過抑制Cox-2從而限制前列腺素產生的非甾體類抗炎藥）也可以明顯減少實驗鼠扭體次數，進一步證實PGE2在這一痛反應中的作用。以上結果表明，激活IRE1αlpha-XBP1通路促進了醋酸誘發的內臟痛。

接下來，研究者又研究了白細胞內的IRE1αlpha缺陷是否影響術后疼痛，其由PGE2介導，一般情況下用Cox-2抑制劑對其進行治療。分別在Ern1f/f和Ern1f/f Vav1cre鼠右后腳掌予手術切口，在不同時間點監測其非反射性痛行為，并與術前基礎值進行對比分析。術后24 h，在損傷部位分離出的CD45+白細胞中發現了IRE1αlpha依賴的Xbp1剪接體。盡管此時中性粒細胞、巨噬細胞和DCs浸潤病損部位的比例沒有發生改變，但發現在Ern1f/f Vav1cre鼠浸潤切口部位，表達Cox-2的白細胞數量顯著減少（與Ern1f/f鼠比較）。承重分布實驗研究表明，與Ern1f/f鼠比較 IRE1αlpha缺陷的Ern1f/f Vav1cre鼠表現出更好的使用傷足的能力，它們在手術后的早期階段表現出更為平衡的后爪承重分布，并且術后恢復也更快，這一表型與兩種鼠的體重無關。在Ern1f/f Vav1cre鼠，自發痛行為如面部表情評分和防御評分也明顯降低。用von Frey測定的機械痛閾值在Ern1f/f鼠和Ern1f/f Vav1cre鼠之間無統計學差異，這與先前報道在急性痛嚙齒動物模型中的外周Cox-2在誘發的機械敏化中的作用可以忽略不計相一致。Ern1f/f鼠和Ern1f/f Vav1cre鼠術后甩足次數及足底周長也無明顯差異。性別對比發現白細胞內源性IRE1αlpha在這些術后反應中的作用在雌雄不完全相同，如Ern1f/f Vav1cre鼠雄與Ern1f/f雄鼠比較，表現出的受損程度更輕、恢復更快，而雌鼠中沒有發現這種差異。

為研究IRE1αlpha是否可以作為藥靶而調節術后疼痛，在術前給予小鼠注射MKC8866，結果發現IRE1αlpha抑制劑能夠改善傷害性功能，表現為與溶劑對照組相比承重分布更加均衡，給予MKC8866小鼠的面部表情評分及防御評分均出現顯著降低。但與在Ern1f/f Vav1cre鼠的實驗結果有所不同，MKC8866組鼠的甩足活動減少，表明其他非白細胞中的IRE1αlpha也有致痛作用。MKC8866組鼠的飼養活動改變不明顯，表明若想使雄鼠術后表現出特定行為變化，可能需要對IRE1αlpha的完全抑制才行。與IRE1αlpha敲除鼠的實驗結果相同，MKC8866組鼠的機械痛敏不變。類似的實驗結果也在給予KIRA實驗鼠上觀察到。作為陽性對照的Celecoxib，與抑制IRE1αlpha的結果相似，即與溶劑對照組相比，Celecoxib鼠在術后表現出更加平衡的承重分布、面部表情評分及防御評分均較低，而甩足、飼養活動和機械痛敏無明顯改變。這與先前的報道一致，即在可比劑量下，Cox-2抑制劑不影響急性痛的機械痛敏。以上結果表明，在兩種不同的PGE2依賴性疼痛模型中，白細胞中IRE1αlpha-XBP1通路缺陷或受抑制小鼠的疼痛反應行為降低，表明IRE1αlpha可作為在體治療以上類型疼痛的藥理學靶標。

三、主要結論

本研究在分子水平和功能水平揭示了內質網應激感受器IRE1αlpha作為前列腺素生物合成和小鼠疼痛反應的重要媒介。表明IRE1αlpha激活轉錄因子XBP1以維持Cox-2和mPGES-1的表達，這兩種限速酶是生成適量的前列腺素所必需的，這是一種以前未被重視的新機制。臨床上，特別是在目前面臨阿片類藥物濫用危機的美國，需要更加有效的疼痛治療藥物。IRE1αlpha-XBP1信號的藥理學調節可能代表了疼痛治療一種新方法，具有更好鎮痛效果、減少阿片類藥物需求和減少阿片類藥物不良反應的潛力。后續的研究應著眼于IRE1αlpha-XBP1信號通路是否調節其他受前列腺素影響的病理生理過程，如懷孕、發熱、過敏以及腫瘤免疫抑制等。