微生物發酵玉米蛋白粉生產富肽飼料的研究

■劉 驥 易春霞 韓業東 王 燕*

（1.齊齊哈爾大學食品與生物工程學院，黑龍江齊齊哈爾161006；2.東北農業大學動物科技學院，黑龍江哈爾濱150030；3.遼寧省畜產品安全監察所，遼寧沈陽110030）

我國蛋白飼料短缺現象嚴重，亟需開發新型富有 營養的蛋白飼料，因此微生物發酵改性玉米蛋白粉前景非常可觀[1]。玉米可溶性蛋白包括玉米醇溶蛋白、玉米黃色素、玉米抗氧化肽、玉米降壓肽、高F值寡肽和玉米蛋白活性肽等[2]，提高其可溶性蛋白含量，可以增加其功能性。鄭喜群等用堿性蛋白酶和米曲霉固態發酵所產生的羧肽酶分別水解玉米醇溶蛋白，制備高F值寡肽[3]。秦旭東等在配合飼料中添加50%提取醇溶蛋白后的玉米蛋白粉飼喂生長豬，試驗組較對照組體重增長的多[4]。吳澤柱采用枯草芽孢桿菌發酵玉米蛋白粉，發酵產生的蛋白酶使玉米蛋白粉的水解度顯著提高[5]。

近年來，對水解蛋白的功能性進行了大量研究，許多研究表明，酶解玉米蛋白粉具有抗氧化活性肽。抗氧化活性肽可以清除體內多余的自由基，自由基本身是無害的電子，是體內正常代謝的產物。但是如果體內抗氧化系統不能代謝多余的自由基，就會產生氧化應激，損傷細胞和產生疾病，例如腹瀉等。當發生仔豬腹瀉時，一般我們采用抗生素來治療疾病，但是抗生素的添加會在畜產品中殘留，易引起食品安全隱患。添加抗氧化肽可以減少疾病的發生，減少抗生素的添加。

玉米蛋白粉特殊的氨基酸序列使其具有產生抗氧化肽的潛力。本文采用酵母菌發酵玉米蛋白粉，尋找最佳的發酵工藝，提高其溶解性和利用率，并測定其抗氧化活性，確定其功能性。

1 材料和方法

1.1 培養基配制及菌種培養

采用產朊假絲酵母進行發酵，采用PDA培養基進行菌種的活化和種子培養基培養。

1.2 試驗方法

1.2.1 單因素試驗

本文采用酵母菌發酵玉米蛋白粉，以可溶性蛋白為指標，優化工藝條件，尋找最佳的發酵工藝。

①料液比條件的確定

初始條件：玉米胚芽餅、玉米黃粉、玉米DDGS和麩皮按2∶1∶1∶1的固料比例加入到250 ml錐形瓶中，固料和水共50 g/250 ml錐形瓶，外加營養成分尿素、硫酸銨、糖蜜各0.5 g/250 ml錐形瓶。接菌量為6%、發酵時間為96 h、發酵溫度為33℃。設置料液比梯度為：1∶0.8，1∶1，1∶1.25，1∶1.4，1∶1.6。每組三個平行實驗。

②接種量條件的確定

條件同上。設置接菌量梯度為：2%、4%、6%、8%、10%。每組3個平行實驗。

③發酵時間條件的確定

條件同上。設置發酵時間梯度為：48、72、96、120、144 h。每組3個平行實驗。

④發酵溫度條件的確定

條件同上。設置發酵溫度梯度為：29、31、33、35、37℃。每組3個平行實驗。

1.2.2 正交試驗

在單因素試驗確定的各因素的最佳工藝參數范圍的基礎上以L9（34）因素水平表，進行測定。

1.2.3 評價指標

可溶性蛋白含量采用福林酚法[6]。

1.2.4 發酵后玉米蛋白粉的蛋白的分子量分布

SDS凝膠電泳的操作方法參照劉成江等[7]的方法。

1.2.5 抗氧化性的測定

參照Zhang等[8]的方法，準確稱取肽，用蒸餾水分別配制成0.5、1、1.5、2、4、6 mg/ml和8 mg/ml的樣品溶液。取1 ml樣品溶液加入試管中，加入0.1 ml 2 mM FeCl2溶液，混勻后加入3.7 ml雙蒸水，然后加入0.2 ml 5 mM菲啰嗪溶液，震蕩搖勻，反應混合物在室溫下放置10 min，在562 nm處測吸光值，以雙蒸水代替樣品作空白對照。

式中：AS——加樣品時在562 nm處測吸光值；

AC——加雙蒸水時在562 nm處測吸光值。

2 結果與分析

2.1 料液比條件的確定

圖1 料液比對產阮假絲酵母菌發酵物中可溶性蛋白含量的影響

由圖1可以看出，當料液比為1∶1時，產阮假絲酵母菌發酵后的產物的可溶性蛋白含量最高，可達到75.34 mg/g。

2.2 接種量條件的確定

由圖2可見，當接種量為8%時，產阮假絲酵母菌發酵后的產物的可溶性蛋白含量最高，可達到88.45 mg/g。

2.3 發酵時間的優化

由圖3可以看出，當發酵時間為120 h時，產阮假絲酵母菌發酵后的產物的可溶性蛋白含量最高，可達到91.56 mg/g。

2.4 發酵溫度的優化

由圖4可以看出，當發酵溫度為35℃時，產阮假絲酵母菌發酵后的產物的可溶性蛋白含量最高，可達到109.01 mg/g。

圖2 接種量對產阮假絲酵母菌發酵物中可溶性蛋白含量的影響

圖3 發酵時間對產阮假絲酵母菌發酵物中可溶性蛋白含量的影響

圖4 發酵溫度對產阮假絲酵母菌發酵物中可溶性蛋白含量的影響

2.5 正交試驗數據及分析

在單因素試驗結果的基礎上選擇對單因素條件影響較大的因素（料液比、接種量和發酵時間）設計正交水平試驗，對各因素組合進行優化。正交試驗設計及結果如表1所示。

表1 L9（34）正交試驗水平

由表2中極差分析可知，可溶性蛋白含量測定時，RA＞RB＞RC，即在正交試驗的3個因素中料液比的影響最大，其次是接種量和發酵時間。

表2 產朊假絲酵母菌發酵工藝優化試驗結果

通過可溶性蛋白含量各水平的和（K1、K2、K3）可知，K1＞K2＞K3，說明料液比1水平為最佳；不同水平接種量的可溶性蛋白的和為K1＞K2＞K3，說明1水平最佳；不同水平的發酵時間的可溶性蛋白的和K2＞K1＞K3，說明2水平最佳。通過正交試驗的顯著性檢驗表3可知，該模型的擬合度是0.984，且模型是顯著的，說明該正交試驗的數據真實有效。通過正交試驗，綜合得出最佳組合為：料液比1∶1.5，發酵時間120 h，接種量15%。通過試驗驗證得到正交最高可溶性蛋白是95.33 mg/ml。

表3 正交試驗的顯著性檢驗

2.6 發酵前后蛋白分子量的分布

通過圖5可以看出，經過酵母菌發酵后的蛋白質的分子量明顯減少，超過31 000 Da的蛋白明顯減少，而小于31 000 Da的蛋白明顯增加，說明發酵使蛋白的分子量降低，使一些不溶的大分子肽轉變成可溶的小分子肽。

圖5 蛋白質電泳圖

2.7 抗氧化活性測定結果

Fe2+與Fenton試劑反應產生羥基自由基，能夠縮短鏈反應引發期的時間，且加快脂類化合物過氧化的反應速度。因此，當物質與金屬離子發生螯合作用后，就可以減弱金屬離子促進脂肪過氧化作用，間接地發揮了抗氧化的效果。

圖6 玉米肽和乙二胺四乙酸同Fe2+的螯合能力

如圖6所示，與EDTA相比，玉米肽展示一個低的鐵離子螯合能力，這與Chen(1998)報道是一致的。Fe2+的清除能力與濃度呈強相關性，當玉米肽1 mg/ml時，螯合能力10%，而當玉米肽濃度為8 mg/ml時，螯合能力可達76.4%，與90 μg/ml EDTA螯合能力相當。Fe2+清除能力很可能依賴于氨基酸的組成和氨基酸的序列。

3 結論

通過產朊假絲酵母發酵玉米蛋白粉，極大地提高了玉米蛋白的可溶性，并測出其分子量降低且具有抗氧化活性肽的產生，理論上可以應用于乳仔豬飼料中應對氧化應激，減少抗生素的使用。