肉雞腸源產細菌素乳酸菌的分離和鑒定

■趙藝竹 張 靜 郭永鵬 趙麗紅

(中國農業大學動物科技學院動物營養學國家重點實驗室，北京100193)

近年來飼用抗生素導致的畜產品抗生素殘留和細菌耐藥性等問題日益嚴峻，因此迫切需要探尋一種能取代抗生素的飼料添加劑。微生態制劑具有無殘留，無耐藥性，對環境友好等諸多優點，并且在提高機體免疫力，促進動物生長，維持機體菌群平衡等方面效果顯著，因而對開發微生態型抗生素替代物的研究非常必要。乳酸菌是微生態制劑中常見菌種，是一類可利用碳水化合物發酵產生乳酸的革蘭氏陽性無芽孢細菌的總稱。乳酸菌是人和動物腸道內的有益菌，且為優勢菌群，其抑菌、促生長作用已經有廣泛研究報道。石峰[1]從健康肉雞盲腸中篩選出一株耐膽鹽，耐酸的乳酸菌，能顯著提高肉雞日增重和降低料重比。Wang等[2]從肉仔雞盲腸內容物中分離篩選出產細菌素的植物乳桿菌CLP29和屎腸球菌CLE34，二者均對沙門氏菌、大腸桿菌具有較好的抑制作用。研究表明，在飼糧中添加抗菌肽，可以增加雞腸道乳酸菌數量，為獲得能夠應用于動物生產及飼料添加的優良乳酸菌種，并為雞源乳酸菌在飼料工業中應用提供依據[3-4]。本試驗從飼喂了抗菌肽（菌絲霉素）的肉雞腸道中分離獲得乳酸菌，擬篩選出同時對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌具有較好抑菌活性的乳酸菌，并對其抑菌活性物質進行初步研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株

指示菌：鼠傷寒沙門氏菌CVCC14028、雞白痢沙門氏菌CVCC519、腸炎沙門氏菌CICC10467、腸炎沙門氏菌CVCC3377、金黃色葡萄球菌CVCC1882、金黃色葡萄球菌ATCC6538、金黃色葡萄球菌CICC23926、金黃色葡萄球菌ATCC43300、大腸桿菌K99、大腸桿菌K88、大腸桿菌987P、大腸桿菌CVCC1515。

1.1.2 培養基

MRS培養基：蛋白胨10.0 g/l、牛肉粉5.0 g/l、葡萄糖 20.0 g/l、酵母 4.0 g/l、乙酸鈉 5.0 g/l、磷酸氫二鉀2.0 g/l、硫酸鎂 0.2 g/l、檸檬酸三銨 2.0 g/l、硫酸錳0.05 g/l、吐溫1 ml、瓊脂粉15 g/l，121 ℃滅菌15 min；

LB培養基：酵母浸出物5.0 g/l、氯化鈉10.0 g/l、胰蛋白胨10.0 g/l、瓊脂粉15.0 g/l，121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 主要試劑與儀器

試劑：過氧化氫酶（Sigma）、蛋白酶K（Merck）、細菌全基因組提取試劑盒（北京莊盟國際生物基因科技有限公司）、瓊脂糖凝膠回收試劑盒（天根生化科技有限公司）、乳酸菌生化鑒定管(青島海博生物)。

儀器：顯微鏡、分析天平、高壓滅菌鍋、pH計、PCR儀、電泳儀、高速冷凍離心機、電熱恒溫水浴鍋、恒溫振蕩培養箱、生化培養箱、紫外分光光度計、電子游標卡尺。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌分離與篩選

選擇飼喂抗菌肽（菌絲霉素）的42日齡健康肉雞，頸部放血致死，無菌采集回盲腸內容物，將內容物用滅菌生理鹽水梯度稀釋后，取10-3梯度稀釋液0.2 ml于固體MRS培養基平板上均勻涂布，37℃恒溫培養箱中培養24 h，挑選具有典型乳酸菌特征的單個菌落反復劃線純化得到純菌株。經分離純化后的菌株接種于MRS液體培養基中，37℃培養24 h，將菌液與滅菌甘油按1∶1混合置于-20℃冰箱保藏。

參考于微等[5]方法制備無細胞菌體發酵液，將活化后的菌株以2%的接種量接入MRS液體培養基中37 ℃培養24 h，將發酵液4 000 r/min，離心5 min，所得上清液經0.22 μm濾膜過濾，保存備用。采用牛津杯法：以金色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌各4株為指示菌，將0.2 ml指示菌涂布于LB固體培養基上，后在水平放置的平皿中均勻放置3個牛津杯，將無細胞菌體發酵液0.2 ml加入牛津杯中。擴散30 min～1 h后移入生化培養箱過夜培養。設置3個重復。

1.2.2 菌株鑒定

①菌體形態鑒定與生理生化鑒定

革蘭氏染色后，顯微鏡下觀察菌體形態。生理生化試驗：包括糖醇發酵試驗、馬尿酸鹽水解試驗等。

②乳酸菌16S rDNA基因序列測定和系統進化樹構建

用細菌全基因組提取試劑盒提取目標菌株的DNA，以 27F和 1492R 為上下游引物（27F：5‘-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’，1492R：5‘-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’），以提取得到的 DNA為模板進行PCR擴增16S rDNA基因。20 μl反應體系：模板 DNA 1 μL，27F，1492R各 1 μl，ddH2O 7 μl，2×Taq Mix 10 μl。PCR反應條件：95 ℃預變性3 min，95℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸10 min，共30個循環72℃延伸10 min后結束。取PCR擴增產物于1%瓊脂糖凝膠中電泳。用瓊脂糖凝膠回收試劑盒，回收并鑒定PCR產物。由上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序，最后將測得的基因序列在NCBI上進行Blast比對，確定其種屬。并利用MAGE 5.0軟件構建系統發育樹。

1.2.3 抑菌物質的確定

將無細胞發酵上清液調至各酶最適pH值，按濃度1 mg/ml分別添加過氧化氫酶、蛋白酶K，37℃保溫2 h，后將pH值調至6.5，以腸炎沙門氏菌CVCC3377為指示菌做抑菌實驗，測量抑菌圈大小。與未處理發酵液的抑菌效果進行對照。將無細胞發酵上清液80℃處理1 h，以腸炎沙門氏菌CVCC3377為指示菌，測定抑菌活性，與未處理作對照，測量抑菌圈大小。

1.2.4 乳酸菌生長曲線與抑菌活性曲線的繪制

將活化12 h后的菌株以2%接種量接入MRS液體培養基中，37℃搖床培養24 h，每隔2 h取樣一次，測其OD600nm值，以OD600nm為縱坐標，時間為橫坐標，繪制乳酸菌生長曲線，并制備無細胞發酵上清液，以腸炎沙門氏菌CVCC3377為指示菌，測量抑菌活性，以抑菌直徑為縱坐標，繪制抑菌活性曲線[6]。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的篩選

采用牛津杯法，選取12株革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌：金色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌各4株為指示菌，進行抑菌試驗，測定所分離乳酸菌無細胞發酵上清液抑菌直徑，篩選出對指示菌株均有較好抑制效果的2株乳酸菌LAB12和LAB19。2株乳酸菌對指示菌均有不同程度的抑制效果。結果見表1。

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 菌株的形態學鑒定與生理生化鑒定

由圖1可見，LAB12和LAB19菌落經革蘭氏染色后，顯微鏡下呈現革蘭氏陽性，LAB12菌體呈圓球形，LAB19呈短桿狀，分別符合片球菌、乳桿菌的菌落形態。

表1 兩株乳酸菌的抑菌活性

圖1 菌株LAB12、LAB19菌落形態

LAB12和LAB19生理生化試驗結果如表2所示。菌株LAB12可發酵水楊苷、纖維二糖、蔗糖、棉子糖、菊糖、乳糖。菌株LAB19可發酵七葉苷、纖維二糖、麥芽糖、甘露醇、水楊苷、蔗糖、菊糖。結合菌落形態和革蘭氏染色觀察結果，可初步判定菌株LAB12為片球菌屬，菌株LAB19為乳桿菌屬。

表2 LAB12和LAB19生理生化特性

2.2.2 菌株的16S rDNA鑒定（見圖2）

運用軟件MAGE 5.0將菌株LAB12和LAB19的16S rDNA基因序列與其他菌株的16S rDNA基因序列構建系統發育樹(1 000次重復抽樣)，結果如圖2所示，菌株LAB12的16S rDNA基因序列與Pediococcus acidilacticiGL16和Pediococcus acidilacticiJCM 15055的16S rDNA基因序列同源性達到了100%。因此，鑒定菌株LAB12為乳酸片球菌。菌株LAB19的16S rDNA基因序列與Lactobacillus plantarumKLDS 1.0728和Lactobacillus plantarumNWAFU1539的16S rDNA基因序列同源性達到了100%。鑒定菌株LAB19為植物乳桿菌。

圖2 16S rDNA擴增結果和基于16S rDNA序列構建的系統發育樹

2.3 抑菌物質的確定（見圖3）

用過氧化氫酶處理后的無細胞發酵上清液，以腸炎沙門氏菌CVCC3377為指示菌，不影響LAB12和LAB19發酵液的抑菌活性，加熱處理和蛋白酶K處理后抑菌活性減小，說明抑菌物質對蛋白酶敏感，且熱不穩定。可以初步確定發酵液上清中抑菌物質為蛋白類物質。

圖3 酶處理和加熱處理后抑菌直徑

2.4 乳酸菌的生長曲線與對腸炎沙門氏菌抑菌作用曲線（見圖4）

乳酸片球菌LAB12在發酵2 h后進入對數生長期，約在18 h進入穩定期，隨著菌體數量增加發酵液上清抑菌作用增強，22 h抑菌活性達到高峰并趨于穩定。植物乳桿菌LAB19在發酵2 h進入對數生長期，經約10 h快速生長后，生長速度趨于穩定，抑菌活性也基本保持不變。兩株乳酸菌無細胞發酵液上清的抑菌活性變化趨勢與其生長趨勢基本一致。

3 討論

3.1 乳酸菌的抑菌能力

在篩選乳酸菌時，其對腸道有害菌的抑制能力是篩選的重要標準。相關研究多以常見病原菌為指示菌，篩選對其具有良好抑制作用的菌株。郭志杰等[7]以大腸桿菌、沙門氏菌為指示菌，得到對其均有較強抑制作用的4株乳酸菌。高擎燏[8]分離篩選了對大腸桿菌K88、K99和雞白痢沙門氏菌均有較好抑制效果的5株乳酸菌。本試驗以大腸桿菌、沙門氏菌、金色葡萄球菌為指示菌，從飼喂菌絲霉素的肉雞腸道中篩選得到了2株乳酸菌LAB12和LAB19，二者的發酵液上清對沙門氏菌和大腸桿菌的抑菌直徑均大于15 mm，對4株金黃色葡萄球菌的抑菌直徑在10～20 mm。所篩選得到的乳酸片球菌LAB12、植物乳桿菌LAB19能夠有效抑制大腸桿菌、沙門氏菌等常見病原菌。

圖4 LAB12、LAB19的生長曲線和對腸炎沙門氏菌CVCC3377的抑菌作用曲線

3.2 乳酸菌產細菌素

由乳酸菌生產的細菌素能夠抑制腸道有害菌如沙門氏菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長，因此篩選得到產細菌素乳酸菌，對保持畜禽腸道健康及開發抗生素替代物具有重要意義。王娟等[9]篩選得到一株產細菌素乳酸菌，抑菌效果良好且適合腸道定植，適合用作飼料添加劑，以促進畜禽腸道健康。本試驗篩選得到兩株乳酸菌LAB12和LAB19，經初步鑒定產生的抑菌物質為細菌素。

3.3 乳酸菌的生長特性

乳酸菌在腸道中繁殖到一定數量時，通過調節機體腸道內菌群平衡，促進動物健康。所篩選出的菌株應具備優良的生長速度和抑菌活性，才能達到較好的益生效果。因此對LAB12和LAB19兩株乳酸菌進行了生長曲線和抑菌活性曲線的繪制。LAB12在接種2 h后進入對數生長期，18 h左右進入穩定期。22 h抑菌活性達到最大且趨于穩定，LAB19在發酵2 h進入對數生長期，經約10 h快速生長后，生長速度趨于穩定，抑菌活性也基本保持不變。根據曲線的趨勢可以判斷，二者在每個時段的細菌數量與發酵液上清的抑菌直徑有對應關系，抑菌作用隨細菌數增多而增強，與大多數研究的結果相似[10-11]。LAB12和LAB19生長速度較快，具有良好的生長特性和抑菌活性，盡管兩株菌來源相同，因菌株本身特性不同，二者的生長速度有所差異。

4 結論

本文從飼喂菌絲霉素的肉雞腸道食糜中，篩選得到2株具有較好抑菌效果的乳酸菌。經形態學、生理生化鑒定和16S rDNA分析確定，菌株LAB12和LAB19分別為乳酸片球菌和植物乳桿菌。通過對LAB12和LAB19發酵液上清的不同處理，初步判斷菌株所產的抑菌物質主要為細菌素。

本研究結果為后續對LAB12和LAB19的發酵條件的優化、所產細菌素的生物學特性等研究提供依據，并為乳酸菌制劑在飼料工業中的應用提供可靠菌種。