復合益生菌制劑對斷奶仔豬生長性能、腹瀉率和營養物質消化率的影響

■宋獻藝 劉 洋 周勝花

(1.山西省農業科學院飼料獸藥研究所，山西太原030000；2.山西省農業科學院畜牧獸醫研究所，山西太原030032)

抗生素在動物生產中的廣泛使用，能夠提高動物生長性能，提高動物抗病能力，但是，抗生素在動物機體殘留，污染環境等嚴重問題日益突出[1]，禁抗的趨勢亟不可待，開發替抗產品是時代所需。益生菌具有能夠提高營養物質消化率、生長性能、免疫力、降低腹瀉率等優點[2-5]，因此是一種重要的替代抗生素產品。益生菌的來源有很多種，可以通過體外試驗篩選同源益生菌及其復合物。Liu等[6]研究表明，添加干酪乳桿菌和腸球菌飼喂斷奶仔豬后能夠提高斷奶仔豬生長性能和免疫能力，維持腸道平衡，降低死亡率和腹瀉率。J?rgensen等[7]研究表明，添加400 mg/kg芽孢桿菌（枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌）能夠提高斷奶仔豬生長性能和營養物質表觀消化率。Deng等[8]研究表明，枯草芽孢桿菌RJGP16和唾液乳桿菌B1具有協同作用，能夠增強腸道免疫力。仇武松等[9]研究表明，添加產朊假絲酵母和枯草芽孢桿菌均能提高湖羊飼料轉化效率并可提高蛋白質消化率，枯草芽孢桿菌的效果明顯優于產朊假絲酵母。但Tanja等[10]研究表明，添加乳酸菌對生長性能和腸道形態并沒有顯著影響。目前關于益生菌制劑的應用以單一菌種研究為主，多種益生菌聯合對動物的研究相對較少，本試驗旨在研究復合益生菌制劑對斷奶仔豬生長性能、腹瀉率和營養物質消化率的影響，為復合益生菌制劑的開發與利用提供一定的技術指導。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

營養肉湯培養基購自北京奧博星生物技術公司；MRS液體培養基、生化鑒定所用全部試劑均為青島海博生物科技有限公司產品；PCR試劑盒、膠回收試劑盒等為Invitrogen公司產品。

1.2 試驗動物

在山西農業大學動物科技學院實驗基地選擇6頭斷奶后1周（28日齡）的飼料中沒有添加抗生素的健康仔豬。

1.3 復合益生菌制劑

復合益生菌制劑為本課題組自行研發，內含乳酸菌、枯草芽孢桿菌、產朊假絲酵母，總有效活菌數大于1010cfu/g。

1.4 試驗動物及設計

選用28日齡斷奶健康杜×長×大三元仔豬80頭（由山西廣聯畜禽有限公司種豬場提供），隨機分成試驗組和對照組，每個組設2個重復，每個重復20頭豬，分別添加0.1%復合益生菌制劑的試驗組和基礎日糧對照組。試驗進行28 d。

1.5 基礎日糧組成及營養水平

基礎日糧為玉米-豆粕型為基礎日糧，粉料，營養需要參照山西廣聯畜禽飼料有限公司企業標準Q/140000SXGL01-2013設計，日糧組成及營養水平見表1。

1.6 飼喂管理

飼養試驗在山西廣聯畜禽有限公司種豬場進行，每天8:00、13:00、19:00飼喂豬群，自由飲水，每次飼喂直至料槽剩余少許飼料為止，并記錄采食量，按常規免疫程序接種和飼養管理。

1.7 測定指標

1.7.1 菌體形態學檢查

純培養后直接觀察其菌落形態，然后并進行革蘭氏染色和孔雀綠染色，在顯微鏡下觀察細菌菌體形態。

1.7.2 16S rRNA序列分析

分離的每株菌采用珠磨法[8]提取總DNA。培養液0.2 ml與1 ml TN150（Tris-NaCl buffer）和150 μl水飽和酚混合，在珠磨儀（Mini-Bead Beater，Biospec，USA）上5 000 r/min珠磨3 min破碎樣品。經三羥甲基氨基甲烷[Tris(hydroxymethyl)aminomethane，Tris]飽和酚和氯仿/異戊醇反復抽提，用乙醇沉淀DNA，適量TE緩沖液（Tris-EDTA buffer）溶解DNA沉淀。

表1 日糧組成及營養水平（干物質基礎）

以細菌通用引物8f[5'CAC GGA TCC AGA GTT TGA T(C/T)(A/C)TGG CTC AG]和1510r[5'GTG AAG CTTACG G(C/F)T ACC TTG CGA CTT]（Invitrogen公司合成）擴增每株細菌16S rRNA基因全序列（Zoetendal等，1998）。反應體系為：10×緩沖液，5 μl；dNTP（10 mmol/l），1 μl；MgCl2（25 mmol/l），4 μl；Taq DNA聚合酶（5 U/μl），0.8 μl；1 μl模板（1～10 ng/ml），上下游引物（10 μmol/l）各1 μl；加無菌雙蒸水至50 μl。PCR反應條件如下：94℃，3 min預變性；94℃，45 sec；58 ℃，45 sec；68 ℃，90 sec，循環35次；68 ℃，7 min。擴增產物分別經Wizard SV Gel和PCR Clean-Up system(Promega，USA)純化后，插入pGEM-T載體（美國，Promega）并轉化入E.coli Top10，再以克隆的引物進行PCR反應以檢測插入子的大小（Wright和Pimm，2003）。插入正確的陽性克隆分別用HhaⅠ、BsaⅠ等限制性內切酶進行酶切，酶切產物用4%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

形態、生化試驗和酶切圖譜完全一樣的作為一個OTU。在每個OTU中選擇一個單克隆用引物SP6、T7進行測序（Invitrogen，上海）。將測序結果在GenBank中進行BLAST分析。

1.7.3 生長性能指標

分別于試驗的開始和結束時對仔豬進行空腹稱重，根據各組仔豬始末體重，計算平均日增重。每日觀察試驗仔豬生長健康狀態，記錄腹瀉豬只頭數、各欄日糧消耗量、死亡仔豬頭數，計算平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI）、料肉比和腹瀉率。

腹瀉率(%)=總腹瀉次數/(總頭數×試驗天數)×100

1.7.4 營養物質消化率

采用全收糞法在試驗開始后的第21～25 d進行為期5 d的消化試驗。糞樣烘干后粉碎過40目篩，放置于-20℃冰箱保存備用。測定試驗日糧和糞樣的干物質、粗蛋白質、總能及粗灰分含量，從而計算其消化率。

1.7.5 經濟效益分析

通過調查每頭豬的增重收入及飼養成本，記算平均毛利。比較試驗組與對照組仔豬的平均毛利，從而對經濟效益進行分析。

1.8 數據處理及統計

試驗數據采用SAS9.3進行t檢驗，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。各組數據均以“平均值±標準誤”表示。

2 結果

2.1 益生菌菌株的分離、鑒定

從斷奶仔豬直腸中共分離出3個菌株，分別命名為B1、C1和S1，見表2。由表2可見，B1和C1分離自MRS培養基，為乳酸菌，C1為球菌，B1均為桿菌；S1分離自營養肉湯培養基，為芽孢桿菌。

表2 分離菌株的形態學結果

分離菌株的16S rRNA基因序列在GenBank中的BLAST結果見表3。結果表明：B1為德氏乳桿菌德氏亞種（Lactobacillus delbrueckii subsp.Delbrueckii），C1為糞腸球菌（Enterococcus faecalis），S1為枯草芽孢桿菌分離種C9-1（Bacillus subtilis isolateC9-1）。

2.2 添加復合益生菌制劑對斷奶仔豬生長性能的影響(見表4)

表4可見，試驗組和對照組平均日采食量差異不顯著（P＞0.05）；試驗組與對照組相比平均末重和平均日增重差異顯著（P＜0.05），添加益生菌制劑比對照組平均日增重提高了20.72%；在料肉比方面，試驗組和對照組分別為1.56和1.78，添加復合益生菌制劑比基礎日糧組料重比降低了12.36%，差異顯著（P＜0.05）；由此可見，飼料中添加復合益生菌制劑能夠提高斷奶仔豬的生長性能。

表3 分離菌16S rRNA基因BLAST結果

表4 復合益生菌制劑對斷奶仔豬生長性能的影響

2.3 添加復合益生菌制劑對斷奶仔豬腹瀉的影晌

表5可見，雖然試驗組腹瀉率和腹瀉指數較對照組差異不顯著(P＞0.05)，但試驗組與對照組相比，腹瀉率下降了22.73%，腹瀉指數也有所下降，證明飼料中添加復合益生菌制劑可以在一定程度上降低斷奶仔豬的腹瀉率。

表5 復合益生菌制劑對斷奶仔豬腹瀉率的影響

2.4 添加復合益生菌制劑對仔豬營養物質消化率的影響

添加復合益生菌制劑對仔豬營養物質消化率的影響見表6，添加復合益生菌制劑的試驗組與對照組相比，粗蛋白、有機物、干物質和總能消化率均有提高，其中總能、有機物分別提高了2.99%和4.15%，但差異不顯著(P＞0.05)；粗蛋白和干物質分別提高5.70%和2.81%，差異顯著(P＜0.05)。可見，復合益生菌制劑可在一定程度上提高仔豬對營養物質的消化能力，從而提高飼料利用率。

表6 復合益生菌制劑對仔豬營養物質消化率的影響(%)

2.5 經濟效益分析

在水電、人工、管理等費用不計算在內的前提下，由表7知，對照組平均每頭豬可獲毛利36.42元，試驗組平均每頭豬可獲毛利49.39元，平均每頭豬試驗組比對照組多獲利12.97元，經濟效益十分可觀。

表7 復合益生菌制劑對仔豬生產經濟效益分析

3 討論

3.1 益生菌菌株的分離、鑒定

動物消化道微生物具有多樣性和特異性，寄主和腸道菌之間存在著相互選擇、相互依賴的關系[10]。本試驗從斷奶仔豬消化道分離的2株乳酸菌和1株芽孢桿菌，來源于消化道，更容易適應腸道環境，從而能更好地在仔豬體內定植發揮益生作用。

3.2 添加復合益生菌制劑對斷奶仔豬生產性能的影響

一般情況下，動物消化道內含有大量的有益微生物用來維持消化道的菌群平衡，但斷奶仔豬腸道發育不成熟，因此，大量研究表明，添加益生菌飼喂斷奶仔豬后能夠提高其生長性能，提高仔豬免疫力和腸道微生物數量[6，11-13]。辛娜等[14]研究結果表明，飼喂芽孢桿菌對斷奶仔豬的平均日增重及飼料轉化率均沒有影響。Rolfe[15]研究表明，復合菌比單一菌效果更好。本研究認為飼料中添加復合益生菌制劑能夠提高斷奶仔豬的生長性能，這與前人的研究結果一致。

3.3 添加復合益生菌制劑對斷奶仔豬腹瀉率的影響

規模化豬場的不斷完善和發展，早期斷奶作為提高母豬生產力的重要措施之一，但同時早期斷奶仔豬腸道微生物群系受到破壞而產生應激，有益菌減少，大腸桿菌等有害菌大量繁殖，容易引起仔豬腹瀉。黃金華等[16]研究表明，添加復合益生菌制劑(植物乳桿菌、嗜酸性乳桿菌、地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、釀酒酵母)能夠顯著降低斷奶仔豬腹瀉率。劉虎傳等[17]研究表明，添加益生菌(植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌)飼喂斷奶仔豬后能夠顯著降低腹瀉率。本試驗結果表明，添加復合益生菌制劑能夠顯著降低腹瀉率，這與前人的結果一致。

3.4 添加復合益生菌制劑對斷奶仔豬營養物質消化率的影響

益生菌在腸道內發酵，能夠促進營養物質的消化吸收。黃金華等[16]研究表明，添加復合益生菌飼喂斷奶仔豬后能夠顯著提高日糧的總能、粗蛋白質、粗脂肪、粗纖維、灰分、鈣、磷的消化率。Giang等[18]研究表明，添加乳酸菌復合菌飼喂斷奶仔豬后能夠提高粗蛋白、粗纖維和有機物的回腸表觀消化率。本研究表明，能夠顯著提高粗蛋白和干物質的消化率，對有機物和總能的消化率具有提高的趨勢，但差異不顯著。這與前人的結果尚存在一定的差異，這可能與日糧組成、環境、豬品種等因素有關。

4 結論

添加復合益生菌制劑飼喂斷奶仔豬后能夠提高其生產性能、營養物質消化率，降低腹瀉率，同時提高純收入，因此0.1%添加復合益生菌制劑應用于仔豬生產的前景十分廣闊。