伊貝母鱗莖和莖段的組織培養(yǎng)

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(遼寧農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，遼寧 營(yíng)口 115009)

新疆野生貝母種質(zhì)資源豐富，花色絢麗，花型多姿，并具有高抗寒性、早春開花的優(yōu)點(diǎn)，在遼寧、北京、長(zhǎng)沙等地引種均已獲得成功[1-2]，極其適合我國(guó)北方高寒地區(qū)園林美化[3]。伊貝母(F.pallidiflora)是其中一種觀賞價(jià)值較高的新疆野生貝母[4]。伊貝母自然繁殖系數(shù)低、人工生產(chǎn)技術(shù)難度大，目前對(duì)其開發(fā)利用的材料主要來源于野生資源，然而由于人工的過度采挖，造成野生資源逐漸枯竭，極大的限制了伊貝母在園林上的大面積推廣應(yīng)用。離體培養(yǎng)是當(dāng)前珍稀名貴植物品種種質(zhì)保存和快速繁殖的最有效途徑，通過離體培養(yǎng)可以達(dá)到伊貝母快速繁殖、保護(hù)野生資源和促進(jìn)園林應(yīng)用推廣的目的。本試驗(yàn)以伊貝母鱗莖和莖段為外植體，探討外植體消毒和培養(yǎng)條件對(duì)其不定芽誘導(dǎo)、增殖、生根情況的影響，建立伊貝母組培快速繁殖體系，為進(jìn)一步開展伊貝母的種質(zhì)資源保存、繁育和擴(kuò)大其園林應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與培養(yǎng)條件

1.1.1 材 料

供試用伊貝母的鱗莖和莖段均于2017年3月28日采自遼寧農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院花卉基地栽植的出苗期植株。

1.1.2 培養(yǎng)條件

以MS為基本培養(yǎng)基，附加30 g/L蔗糖、7 g/L瓊脂，調(diào)節(jié)pH值為5.8～6.0，添加不同濃度IBA、NAA、6-BA等激素。所有培養(yǎng)基均在121 ℃條件下高壓滅菌15 min。培養(yǎng)條件為溫度(23±1)℃、空氣相對(duì)濕度60%～70%、光照時(shí)間13 h/d、光照強(qiáng)度1 000～1 500 lx。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體的消毒與處理

選取白嫩、健康的新鮮貝母地下鱗莖，置于干燥陰涼通風(fēng)的環(huán)境中，待表層土干后再用軟毛刷彈去塵土，然后用75%的酒精棉球全面擦拭，將內(nèi)外層鱗莖從鱗莖盤上輕輕剝離備用；選取自基部向上含2～4節(jié)、長(zhǎng)4～6 cm莖段，剪去多余葉片，葉基留0.5 cm左右備用。所有選取的材料先在自來水下沖洗1～2 h，再在無菌超凈工作臺(tái)進(jìn)行消毒滅菌。鱗莖外植體消毒滅菌采用2種處理，處理L1：按75%乙醇30 s+無菌水沖洗2次+2%次氯酸鈉14 min+無菌水沖洗3次程序消毒；處理L2：按75%乙醇30 s+無菌水沖洗2次+0.5%次氯酸鈉8 min+無菌水沖洗3次+2%次氯酸鈉6 min+無菌水沖洗3次程序消毒。莖段消毒同樣采用2種處理：處理J1：75%乙醇30 s+無菌水沖洗2次+2%次氯酸鈉6 min+無菌水沖洗3次；處理J2：75%乙醇30 s+無菌水沖洗2次+0.5%次氯酸鈉2 min+無菌水沖洗3次+0.5%次氯酸鈉4 min。消毒后內(nèi)層細(xì)小鱗莖直接備用；外層鱗莖直接切割成0.6 cm2大小備用；莖段剪切成含莖節(jié)0.5～0.8 cm長(zhǎng)備用。所有外植體材料消毒后接種于附加不同激素組合的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，每個(gè)處理接種30塊外植體，重復(fù)3次，接種2周后統(tǒng)計(jì)污染率。

注：1為鱗莖；2為莖段；箭頭所指為誘導(dǎo)的芽。圖1 伊貝母鱗莖和莖段的不定芽誘導(dǎo)

污染率(%)=(污染數(shù)/接種總數(shù))×100%。

1.2.2 不同激素組合對(duì)伊貝母鱗莖和莖段誘導(dǎo)不定芽的影響

將消毒后的伊貝母鱗莖塊和莖段分別接種于不同濃度植物激素組合的9種MS培養(yǎng)基上(見表1、表2)，每種培養(yǎng)基接種30塊，重復(fù)3次，接種35 d后觀察并統(tǒng)計(jì)芽誘導(dǎo)率和生長(zhǎng)情況。

1.2.3繼代培養(yǎng)基的選擇

分別選用鱗莖和莖段誘導(dǎo)出的不定芽，轉(zhuǎn)移到含有不同濃度植物激素組合的9種MS培養(yǎng)基上(見表3、表4)，每種培養(yǎng)基接種30個(gè)，重復(fù)3次，培養(yǎng)35 d后觀察記錄叢生芽增殖倍數(shù)和生長(zhǎng)情況。

1.2.4 生根培養(yǎng)

當(dāng)苗高長(zhǎng)至2～3 cm時(shí)將其從基部切下，接種到不同濃度激素組合的1/2 MS培養(yǎng)基中(見表4)，每種培養(yǎng)基接種30個(gè)，重復(fù)3次，培養(yǎng)50 d后統(tǒng)計(jì)生根率和生長(zhǎng)情況。

2 結(jié)果和分析

2.1 滅菌方法對(duì)伊貝母鱗莖和莖段消毒的影響

由表1可知，不同消毒處理對(duì)伊貝母鱗莖消毒效果差異顯著，對(duì)莖段的消毒效果差異不明顯。處理L1：鱗莖消毒效果較差，外植體污染率高達(dá)78.3%；處理L2：即次氯酸鈉在同樣的消毒時(shí)間內(nèi)采用不同濃度的2次處理消毒效果最佳，污染率僅為3.8%。相對(duì)鱗莖外植體來說，莖段外植體的污染率非常低，且2種消毒處理方式效果差異不大。從試驗(yàn)效果和實(shí)驗(yàn)手段簡(jiǎn)捷的方面出發(fā)伊貝母鱗莖的最佳消毒方式是70%乙醇+0.5%次氯酸鈉1次消毒后用2%次氯酸鈉進(jìn)行2次消毒；莖段則是70%乙醇+2%次氯酸鈉1次消毒效果最好。

2.2 不同激素組合對(duì)伊貝母鱗莖和莖段不定芽誘導(dǎo)的影響

消毒后的伊貝母鱗莖和莖段接種到含有不同濃度激素組合的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)15 d后，材料在鱗莖切處、莖段莖節(jié)處分化出愈傷組織，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，愈傷組織塊逐漸增大，35 d后，在愈傷組織逐漸分化出芽(圖1)。48 d時(shí)統(tǒng)計(jì)芽誘導(dǎo)率。

誘導(dǎo)率(%)=(誘導(dǎo)出芽的外植體總數(shù)/接種總數(shù))×100%。

表1 滅菌方法對(duì)伊貝母鱗莖和莖段消毒的影響

處理鱗莖接種數(shù)污染率(%)存活狀態(tài)處理莖段接種數(shù)污染率(%)存活狀態(tài)L13078.6染菌嚴(yán)重J1302.4染菌較重L2303.8生長(zhǎng)較好J2300.0生長(zhǎng)較好

由表2和表3可知，不同濃度激素組合對(duì)鱗莖和莖段的芽誘導(dǎo)率影響較大。較低濃度的6-BA對(duì)芽的誘導(dǎo)率不高，濃度達(dá)3 mg/L時(shí)反而抑制了芽的發(fā)生。NAA則隨著濃度的升高誘導(dǎo)率略有提高。綜合來看，MS培養(yǎng)基添加2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA作為伊貝母鱗莖誘導(dǎo)芽的較優(yōu)激素組合培養(yǎng)基；而MS培養(yǎng)基添加1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA作為伊貝母莖段誘導(dǎo)芽的較優(yōu)激素組合培養(yǎng)基。

由此，戰(zhàn)場(chǎng)當(dāng)在一臨近洛陽“馬市”的“石橋”，即建春門石橋，而非河橋。北魏酈道元《水經(jīng)注》對(duì)“建春門石橋”和“河橋”均有記載：

表2 不同激素對(duì)伊貝母鱗莖不定芽誘導(dǎo)的影響

6-BA(mg/L)NAA(mg/L)芽誘導(dǎo)率(%)生長(zhǎng)狀態(tài)0.10―1.00.26.4愈傷組織少,芽量少、小、壯0.59.7愈傷組織多,芽量少、小、弱0.12.4無愈傷組織,個(gè)別出單芽,小2.00.286.8愈傷組織適中,芽量較大,長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)0.566.2愈傷組織適中,芽量大,長(zhǎng)勢(shì)一般0.10―3.00.224.2愈傷組織一般,芽弱,長(zhǎng)勢(shì)差0.519.6愈傷組織過盛,芽弱小

2.3 不同激素組合培養(yǎng)基對(duì)不定芽的繼代培養(yǎng)的影響

將伊貝母鱗莖和莖段誘導(dǎo)出的不定芽轉(zhuǎn)移到不同濃度激素組合的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)15 d后發(fā)現(xiàn)在外植體塊上長(zhǎng)出很多新芽(見圖2)。

注：箭頭所指為增殖的芽。圖2 繼代培養(yǎng)后出現(xiàn)大量的芽

表3 不同激素對(duì)伊貝母莖段不定芽誘導(dǎo)的影響

6-BA(mg/L)NAA(mg/L)芽誘導(dǎo)率(%)生長(zhǎng)狀態(tài)0.10外植體莖段變褐枯死0.50.20外植體莖段變褐枯死0.50外植體莖段變褐枯死0.10外植體莖段失綠1.00.289.2愈傷組織適中,芽量大,長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)0.554.9多數(shù)愈傷組織生長(zhǎng)過旺,失色變褐0.10外植體莖段失綠2.00.210.8愈傷組織量少,芽量小,長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)0.50外植體莖段失綠、死亡

表4 不同激素對(duì)伊貝母鱗莖的不定芽繼代培養(yǎng)的影響

6-BA(mg/L)NAA(mg/L)增殖系數(shù)芽生長(zhǎng)情況0.11.0單芽向上生長(zhǎng)、緩慢,無新芽分化0.50.21.5半數(shù)分化1芽,半數(shù)單芽、生長(zhǎng)緩慢0.51.0單芽向上不生長(zhǎng),稍有愈傷化0.12.5分化出2～3芽,向上生長(zhǎng)、健壯1.00.25.3分化4～6芽,長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)、健壯0.51.7基部有愈傷產(chǎn)生,芽分化少、弱0.12.2分化2～3芽,向上生長(zhǎng)、健壯2.00.26.4分化5～7芽,向上生長(zhǎng)、細(xì)弱0.51.1原芽愈傷化,幾乎無芽分化

35 d后統(tǒng)計(jì)不同培養(yǎng)基中增殖的芽數(shù)(如表3所示)，6-BA和NAA組合的培養(yǎng)基都能不同程度促進(jìn)鱗莖和莖段誘導(dǎo)的不定芽的增殖；隨著激素濃度的升高，增殖倍數(shù)也有所增加；但當(dāng)6-BA和NAA激素濃度分別達(dá)2.0 mg/L和0.5 mg/L時(shí)，新生芽的玻璃化現(xiàn)象嚴(yán)重。因此，最優(yōu)伊貝母鱗莖誘導(dǎo)芽的繼代培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基添加1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA(表4)。伊貝母莖段誘導(dǎo)芽的繼代培養(yǎng)基表現(xiàn)與鱗莖的類似，以MS培養(yǎng)基添加0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA的為最佳繼代培養(yǎng)基。

2.4 生根培養(yǎng)

將不定芽接種到不同激素濃度組合的生根培養(yǎng)基上，大約20 d后長(zhǎng)出細(xì)根，在誘導(dǎo)根形成的同時(shí)，不定芽進(jìn)一步分化形成了小鱗莖，即分化成完整的再生植株。

表5 不同激素對(duì)伊貝母莖段的不定芽繼代培養(yǎng)的影響

6-BA(mg/L)NAA(mg/L)增殖系數(shù)芽生長(zhǎng)情況0.11.0單芽向上生長(zhǎng)、快,無新芽分化0.20.21.0單芽向上生長(zhǎng)、慢,無新芽分化0.51.0單芽向上不生長(zhǎng),愈傷化0.12.3分化出2～3芽,向上生長(zhǎng)、健壯0.50.25.7分化4～6芽,長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)、健壯0.51.0基部產(chǎn)生愈傷0.12.7分化2～3芽,向上生長(zhǎng)、健壯1.00.26.7分化5～7芽,向上生長(zhǎng)、細(xì)弱0.51.1原芽愈傷化,幾乎無芽分化

如表6所示，添加0.05 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA的1/2 MS培養(yǎng)基中生根率和根長(zhǎng)分別為96.4%和4.2 cm，明顯高于其它培養(yǎng)基中的。

表6 不同激素對(duì)生根培養(yǎng)的影響

NAA(mg/L)IBA(mg/L)生根率(%)根平均長(zhǎng)度(cm)根生長(zhǎng)狀況0.1096.52.2毛狀根、0.050.0598.64.22～5條根、白、健壯00.185.83.6多數(shù)1條根,生長(zhǎng)健壯0.10.184.43.5毛狀根細(xì)、弱,一碰即掉

注：箭頭所指為誘導(dǎo)的根。圖3 誘導(dǎo)生成的根

3 討 論

在植物組織培養(yǎng)中，無菌外植體的獲得是決定組培成功的關(guān)鍵[5,6,11]。由于伊貝母鱗莖取自土壤之中，而且鱗莖表皮不光滑，極易導(dǎo)致消毒不徹底而污染。本試驗(yàn)中，采用70%乙醇和2%次氯酸鈉1次消毒后用0.5%次氯酸鈉進(jìn)行2次消毒，效果較好，污染率僅為3.8%；而常規(guī)1次消毒的污染率高達(dá)78.6%。由于莖段不接觸土壤，因此消毒相對(duì)容易，以70%乙醇+2%次氯酸鈉組合消毒效果最好。

研究表明，MS培養(yǎng)基添加適宜濃度的植物激素可成功誘導(dǎo)不定芽[5,7-8]，NAA、6-BA、KT、TDZ和2,4-D不同組合均可誘導(dǎo)不定芽。本試驗(yàn)結(jié)果表明，2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA組合伊貝母鱗莖不定芽的誘導(dǎo)率最高，芽的生長(zhǎng)狀態(tài)最好；1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA伊貝母莖段不定芽的誘導(dǎo)率最高。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，不定芽的增殖培養(yǎng)，1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA組合對(duì)鱗莖誘導(dǎo)芽的增殖系數(shù)最高，達(dá)8.9；0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA組合最適合莖段誘導(dǎo)芽的繼代培養(yǎng)。研究發(fā)現(xiàn)，貝母組織培養(yǎng)中外植體普遍采用鱗莖[7,10]，鱗莖做外植體時(shí)小鱗莖的誘導(dǎo)率源于高于莖段作為外植體時(shí)的誘導(dǎo)率[10]。本試驗(yàn)研究結(jié)果顯示，伊貝母鱗莖或莖段做外植體，小鱗莖的誘導(dǎo)率差別不大。

直接誘導(dǎo)小鱗莖可以極大地縮短貝母的生產(chǎn)周期[10]。眾多研究表明，貝母外植體再生小鱗莖多通過外植體先形成愈傷組織，愈傷組織再進(jìn)一步分化成不定芽，由不定芽再生成小鱗莖，也有從外植體直接分化出不定芽和小鱗莖的[9-10,12]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，伊貝母再生小鱗莖主要是通過前一種途徑，在不定芽誘導(dǎo)生根的過程中，芽普遍繼續(xù)分化為小鱗莖。