豬苓苓種質量分級的初步研究

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(1.河北農業大學農學院/河北省作物生長調控實驗室，河北 保定 071001；2.河北省淶源縣崟茂豬苓種植場，河北 淶源 074300)

豬苓[Polyporusumbellatus(Pers.)Fr.]為藥用真菌，又叫豕苓、豬茯苓、野豬屎、地烏桃，分類學上屬于無隔擔子菌亞綱(Holoba-sidiomycetidae)、無褶菌目(Aphyllophorales)、多孔菌科(Polyporaceae)、多孔菌屬(Polyporus)[1]。其性平，味甘淡，具利水滲濕的功效，用于水腫，淋濁，泄瀉，帶下和小便不利[2]。隨著以豬苓為原料的成品藥如豬苓多糖注射液、豬苓湯、豬苓散等不斷開發，野生豬苓已不能滿足原料藥材需求，人工栽培豬苓一定程度上緩解了豬苓藥材的供需緊張狀況。目前人工栽培豬苓主要是無性繁殖(即用豬苓苓種做繁殖材料，與蜜環菌伴栽，苓種得到蜜環菌提供的養分后菌絲迅速繁殖，突破菌核表皮層，長出白色幼小的苓頭并不斷增大，形成新的豬苓)，如果苓種質量不合格，或者使用退化苓種均可能導致接菌率低或空窩。因此，開展豬苓苓種質量的調查研究，制定相應的苓種分級指標，可有效規范豬苓苓種市場，為豬苓人工栽培提供有力保證。

表1 豬苓苓種樣品來源

批次苓種產地及生長方式批次苓種產地及生長方式1淶源縣崟茂豬苓種植場 仿野生3年7淶源縣留家莊鄉坡水村 野生多年2淶源縣崟茂豬苓種植場 仿野生4年8淶源縣留家莊鄉小道村 野生多年3淶源縣崟茂豬苓種植場 仿野生5年9淶源縣留家莊鄉團圓村 野生多年4赤城縣樣田鄉雙山寨村 仿野生2年10淶源縣留家莊鄉石片村 野生多年5赤城縣樣田鄉雙山寨村 仿野生3年11淶源縣上莊鄉橫山嶺村 野生多年6淶源縣留家莊鄉伊家鋪村 野生多年12淶源縣東團堡鄉箭桿河村 野生多年

關于豬苓苓種的質量，多憑形態評判質量優劣和人工挑選苓種。張世榮認為，苓種應選擇表面凹凸不平，多疤狀，色澤鮮艷，手捏有彈性，鮮嫩不干漿，生活力強，出芽快而多的灰苓或者黑苓做種；白苓易腐爛，不能做種[3]。王天媛等認為，年幼生命力強，斷面菌絲白色，含水率大，萌發新點多的灰苓適合作苓種[4]。陳文強等認為，具彈性、斷面菌絲為白色或微黃色、新鮮無霉變的黑苓也可作苓種[5]。綜上，生產中豬苓苓種質量良莠不齊，目前尚無苓種質量的檢驗規程，缺乏具體的質量評價指標。本試驗廣泛收集河北省淶源、赤城等不同批次的豬苓苓種樣品，參考淮山藥[8]、懷地黃[7]、姜黃[8]、知母[9-10]等種苗質量分級研究方法，測定分析豬苓苓種的單苓鮮重、密度、色澤、硬度、苓種活力、含水率等指標，初步確定豬苓苓種的質量分級指標，為豬苓苓種的質量評價和生產提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試豬苓苓種樣品來源于不同產地和不同生長年限的12批次豬苓苓種(詳見表 1)，經河北農業大學楊太新教授鑒定為多孔菌科豬苓。

1.2 試驗儀器

LX-C型邵氏硬度計，CR-400色差計，DHG-9240 A電熱恒溫鼓風干燥箱，BS-223 S電子分析天平，HCP-100手提式高速中藥粉碎機，BIC-250型智能光照培養箱，MLS-3750型高壓蒸汽滅菌器，HS-1300-U潔凈工作臺，游標卡尺，干燥器，刀片，鑷子，吸水紙，無菌棉，鋁盒，培養皿，溢流杯，量筒等。

1.3 試驗方法

采用隨機取樣法，每批次樣品選取具有代表性苓種30個，逐個測定其單苓鮮重、密度[11]、色澤[12-13]、硬度[14]、苓種活力和含水率等指標。

單苓鮮重：將苓種表面清洗干凈，用吸水紙吸干表面水分，然后用千分之一電子天平進行稱量。

密度：借助阿基米德原理(浮力法)測量，將苓種浸入盛滿水的溢流杯中，溢出的水用量筒接取，讀數為苓種體積；苓種密度為單苓鮮重與對應苓種體積的比值。

色澤：使用色差計進行測定，以白陶瓷板為標準值校準后，對苓種斷面(將苓種切出直徑約2 cm的斷面)進行色澤測定，結果包括L*、a*、b*值。L*代表苓種斷面亮度，L*的取值范圍為0～100，L*越小越接近黑色，L*越大則越接近白色；a*代表苓種斷面紅綠度，a*=0時為灰色，+a*表示紅色，-a*表示綠色；b*代表苓種斷面黃藍度，b*=0時為灰色，+b*表示黃色，-b*表示藍色。

硬度：將硬度計垂直于切出的斷面，在均勻力的作用下將壓頭壓入，以此時指針的讀數作為苓種的硬度值，重復6次，取平均值作為該苓種的硬度值。

苓種活力的測定：將豬苓苓種清洗干凈，放入0.2%的金霉素溶液中浸一下，立即取出，用無菌棉擦干凈，然后按無菌操作要求，用刀片從豬苓苓種中間切開，用無菌鑷子在菌核中央挑取一塊0.3 cm大小的菌肉[15]，迅速將其放于制備好的PDA培養基上，置于(23±2)℃[16]條件下培養。分別在第15天和第30天測量菌落直徑，以菌絲體日均生長速度(15 d內菌落直徑的生長量除以15)為評價活力的指標。

含水率的測定：將挑取菌絲后的苓種用粉碎機粉碎，置于已知重量的小鋁盒內，半蓋盒蓋，用電子天平稱重記錄后，置于(103±2)℃的恒溫烘箱內。7 h后取出，蓋好蓋子，放入裝有硅膠的干燥器中，打開蓋子，冷卻至室溫，蓋好盒蓋，取出稱重，進行含水率計算。

苓種含水率(%)=[(W2-W3)/(W3-W1)]×100%(式中：W1為小鋁盒重量；W2為小鋁盒和新鮮豬苓樣品的總重量；W3為小鋁盒和干樣品的總重量)。

1.4 數據分析與等級劃分

試驗結果采用SPSS 22.0軟件進行參數統計分析描述和主成分分析，確定豬苓苓種質量分級指標。

對苓種活力和苓種斷面亮度L*2個指標進行K-聚類并得到聚類結果，對苓種斷面黃藍度b*指標采用種苗參數標準差法[17](以平均值加1倍的標準差作為三等苓種的上限點，平均值作為二、三級的分界點，以平均值減1倍的標準差作為一、二級苓種的分界點)得到b*的等級劃分結果。最后綜合K-中心聚類的聚類結果和種苗參數標準差法的等級劃分結果并結合生產實際，制定出豬苓苓種質量指標的最終分級結果。

2 結果與分析

2.1 豬苓苓種分級指標的確定

2.1.1 豬苓苓種質量指標的測定結果

12批次豬苓苓種的單苓鮮重、密度、硬度、含水率、色澤和苓種活力等指標測定結果如表2所示。豬苓苓種的質量指標以苓種斷面紅綠度a*變化最大，變異系數為0.545，變化范圍為0.45～9.62；其次是單苓鮮重，變異系數為0.446，變化范圍為9.032～40.119 g；再次是苓種活力，變異系數為0.414，變化范圍為0.03～0.631 mm/d；密度、硬度、含水率和苓種斷面黃藍度b* 4個指標的變異系數均較小，在0.217～0.271之間；苓種斷面亮度L*的變異系數最低，為0.102。

表2 豬苓苓種質量指標的統計描述

指標極小值極大值均值標準差變異系數單苓鮮重(g)9.03240.11917.3207.7290.446密度(g/mL)0.1731.2490.6830.1660.243硬度8.6071.8044.5712.100.271含水率(%)19.6879.0740.1010.760.268苓種斷面亮度L*43.8480.7169.617.120.102色澤苓種斷面紅綠度a*0.459.624.102.240.545苓種斷面黃藍度b*1.1430.0420.344.400.217苓種活力(mm/d)0.0300.6310.3300.1370.414

2.1.2 豬苓苓種質量指標的主成分分析

考察特征值λ>1，并綜合考慮方差貢獻率確定最優的主成分數。由主成分分析結果(表3)可見，前3個特征值的累計貢獻率已達68.357%，故取前3個為主成分。說明前3個主成分基本包含了豬苓苓種的大部分指標信息。

取前3個特征值，由主成分的載荷矩陣計算主成分特征向量和特征根(表 4)，得到以下3個主成分表達式：

F1=0.051×單苓鮮重+0.256×密度+0.048×硬度+0.285×含水率-0.481×L*+0.376×a*+0.541×b*-0.544×苓種活力；

F2=-0.193×單苓鮮重+0.638×密度-0.709×硬度-0.024×含水率-0.036×L*-0.151×a*-0.132×b*+0.107×苓種活力；

F3=0.851×單苓鮮重+0.023×密度+0.200×硬度+0.229×含水率+0.223×L*+0.041×a*+0.221×b*+0.285×苓種活力。

表3 主成分變量解釋

主成分方差貢獻貢獻率(%)累積貢獻率(%)12.98337.28437.28421.44218.02655.3131.04413.04768.35740.9111.37179.72850.7919.89189.61960.3924.90294.52170.3734.65799.17880.0660.822100

表4 主成分特征向量和特征根

項目特征向量特征根主成分123123單苓鮮重0.088-0.2320.870.051-0.1930.851密度0.4420.7660.0230.2560.6380.023硬度0.0830.8510.2040.0480.7090.200含水率0.4920.0290.2340.2850.0240.229L*-0.8300.0430.228-0.4810.0360.223a*0.650-0.1810.0420.376-0.1510.041b*0.934-0.1580.2260.541-0.1320.221苓種活力-0.940.1280.291-0.5440.1070.285

綜上，第1個主成分的方差貢獻率最高，又因在第1個主成分表達式中，苓種活力、苓種斷面黃藍度b*和苓種斷面亮度L*的系數均較其他幾個指標的系數大，因此可以把苓種活力、苓種斷面黃藍度b*和苓種斷面亮度L*確定為苓種質量分級的指標。

2.2 豬苓苓種質量指標等級初步劃分

采用SPSS 22.0軟件進行K-聚類分析，將苓種質量指標中苓種活力和苓種斷面亮度L*2個指標聚為3類(表 5)。

表5 豬苓苓種活力和斷面亮度L*的最終聚類結果

指標類別1類別2類別3苓種活力(mm/d)0.1640.2480.399苓種斷面亮度L*53.9565.3374.34

采用1.4中種苗參數標準差法對苓種質量指標苓種斷面黃藍度b*進行劃分，結果見表 6。

表6 豬苓苓種斷面黃藍度b*的劃分結果

級別ⅠⅡⅢ苓種斷面黃藍度b*15.9420.3424.74

2.3 苓種質量指標的分級結果

根據豬苓苓種活力和斷面亮度L*的最終聚類結果和斷面黃藍度b*的劃分結果，并結合豬苓生產中的苓種大小，得到各等級分級結果，見表7。

表7 豬苓苓種質量分級指標

指標ⅠⅡⅢ苓種活力(mm/d)≥0.399≥0.248≥0.164苓種斷面亮度L*≥74≥65≥54苓種斷面黃藍度b*≤16≤20≤25單苓鮮重(g)≥10.0≥10.0≥10.0

3 結論與討論

目前，中藥材種子種苗質量分級的研究多見報道[18-22]。豬苓屬于真菌類中藥材，豬苓苓種質量成為人工栽培豬苓的制約因素，前人研究多憑形態判斷苓種質量優劣和人工挑選苓種[3-5]，尚未見苓種質量分級的相關研究。本研究收集不同產地和不同生長年限的12批次豬苓苓種樣品，對苓種質量的各指標進行了測定分析，并采用k均值聚類法和標準差法相結合將豬苓苓種初步分為3個等級。一級苓種：苓種活力≥0.399 mm/d，苓種斷面亮度L*≥74，苓種斷面黃藍度b*≤16；二級苓種：苓種活力≥0.248 mm/d，苓種斷面亮度L*≥65，苓種斷面黃藍度b*≤20；三級苓種：苓種活力≥0.164 mm/d，苓種斷面亮度L*≥54，苓種斷面黃藍度b*≤25。且各等級苓種均應：單苓鮮重≥10.0 g。建議豬苓人工栽培時選用一、二級苓種，利于提高苓種接菌率和豬苓產量，該分級結果為豬苓苓種的質量評價和指導豬苓苓種生產提供參考。

本研究通過對豬苓苓種的苓種活力、斷面色澤、密度、硬度、含水率、單苓鮮重等指標研究，初步確定了分級的4項指標。苓種活力在一定程度上直接反映了苓種內部菌絲的生活力，這與王天媛等[4]的研究結果一致。苓種斷面亮度L*可反映苓種菌絲白色程度，苓種斷面黃藍度b*可反映苓種菌絲的黃色程度，均能夠反映苓種生活力高低，這與陳文強等[5]的研究結果一致。單苓鮮重反映苓種的大小，也與苓種含水率密切相關，生產中可進行人工控制，單苓重較大時人工栽培的用種量大，生產成本高，較小則影響苓種的接菌率和豬苓產量，因此也將其作為分級指標之一。關于豬苓苓種質量的其他指標及其與質量的相關關系有待進一步探討。