吡蟲啉種衣劑對小麥幼苗氮代謝的影響及機制研究

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(河南農業大學植物保護學院，鄭州 450002)

小麥苗期病蟲害是影響小麥產量的主要因素。隨著種衣劑的推廣和應用，通過種衣劑處理小麥種子來預防小麥苗期病蟲害逐漸成為一種重要的農業措施。研究表明，種衣劑可以提高小麥抗氧化酶活性、促進小麥植株生長、提高小麥對逆境和病蟲害的抗性[1-2]，從而達到小麥的高產和穩產。但是，種衣劑對植物產生的負面影響也有報道，例如烯唑醇種衣劑包衣對小麥的出苗時間和出苗率具有抑制作用[3]；戊唑醇懸浮種衣劑對小麥種子萌發的影響主要表現在推遲出苗時間和增加畸形植株數量[4]；三唑類殺菌劑易引起小麥和玉米不同程度的藥害，影響作物幼苗出土、抑制幼苗生長[5]等。

以吡蟲啉(Imidacloprid)為原藥的種衣劑可以由植物根系吸收，持效期長，能有效防治水稻、小麥、甜菜等作物苗期害蟲，尤其對刺吸式口器害蟲有特效[6]。前期的研究發現，吡蟲啉種衣劑會推遲小麥出苗時間，而這種作用產生的原因可能是吡蟲啉種衣劑影響種子吸水性和萌發相關酶活性從而推遲小麥種子萌發[7]。植物體內的氮化物包括蛋白質、氨基酸等，主要用于組成原生質，促進植物生長。在生長初期，植物吸收氮的能力強，以氮素代謝為主，此時正是器官建成時期，需要大量的氮素供應，以防止后期早衰。因此在植物生長初期，氮素代謝對植物生長發育起著重要的作用。關于吡蟲啉種衣劑對植物氮代謝的影響以及這些影響產生的機理目前仍不清楚。本研究在前期研究的基礎上，通過分析吡蟲啉種衣劑對小麥萌發和幼苗生長階段氮代謝途徑關鍵酶活性以及酶編碼基因表達和代謝產物的影響，研究種衣劑對小麥初生代謝的影響，為種衣劑的安全使用提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究材料

矮抗58小麥，購自河南秋實種業科技股份有限公司；600 g/L 吡蟲啉懸浮種衣劑，江蘇龍燈化學有限公司產品，購自鄭州市農藥市場。

1.2 研究方法

1.2.1 拌種處理

吡蟲啉懸浮種衣劑分別設置6.67，13.34 g/kg制劑種子2個濃度梯度(下文中分別以吡蟲啉1.0×和吡蟲啉2.0×表示)，分別取6.67 g和13.34 g吡蟲啉種衣劑，加適量清水稀釋后對1 kg矮抗58小麥種子進行拌種，清水拌種作為空白對照[7]。為了防止種衣劑脫落，種衣劑拌種后的種子在陰涼處晾干后再進行萌發實驗[8]。

1.2.2 萌發試驗

選取不同濃度吡蟲啉包衣小麥種子各25粒置于墊有3層濾紙的加水培養皿中，每處理各3個重復，每個重復含3個培養皿。將培養皿置于培養箱中[(20±1)℃，每日光照16 h，黑暗8 h]培養發芽，每天在同一時間補充相同量的水分，分別在種子萌發第3、6、9、12、15天時隨機取樣，樣品保存于-80 ℃冰箱。

1.2.3 氮代謝相關酶基因表達量測定

根據NCBI已公布的基因序列，設計用于PCR反應的小麥氮代謝相關酶基因引物序列(表1)。采用Trizol法提取樣品RNA，紫外分光光度計測量OD值后，用兩步法反轉錄得到模板cDNA，梯度PCR測定引物的最適退火溫度，再以Actin為目的基因，SYBR?green I 為熒光染料進行實時熒光定量PCR，總體系12μL(SYBR?green I 6μL、上游引物0.5μL、下游引物0.5μL、稀釋5倍的模板cDNA 1μL和雙蒸水4μL)，2-ΔΔC(t)法計算結果。

表1 氮代謝相關酶基因的引物

基因酶參考序列引物序列NR硝酸還原酶X57844.1F:gctgatgcaccacggcttcaR:gggaaaccgttggcaagctcNiR亞硝酸還原酶FJ527909F:attattcgccgtcgtcgtcR:atatgccgccctccgtgaagGS谷氨酰胺合成酶JF894116.1F:gcccttcaccgacaagatcaR:atggcctgtgggtatagaaGOGAT谷氨酸合成酶KF521800F:cgacatcttagcagaacgtggagR:ccatcaccggagtcgttgGDH谷氨酸脫氫酶HQ821868F:gagtgcacaattccgaaagR:gaatattggccacggctgACTINAB181991.1F:tggcatcacacgttctacaacR:gcctggattgcgacata

1.2.4 氮代謝相關酶活性測定

1) 硝酸還原酶(Nitrate reductase，NR)活性測定：參考高俊鳳[9]的方法。樣品加入提取緩沖液及少量石英砂冰浴中研磨勻漿，4 ℃、4 000 r/min離心15 min，所得上清液即為粗酶提取液。取粗酶液0.2 mL，加入0.3 mL 2 mg/mL NADH溶液和0.5 mL 0.1 mol/L KNO3溶液混勻， 25 ℃保溫30 min，以1 mL 30%三氯乙酸作為對照。保溫結束后加入1 mL 30%三氯乙酸搖勻以終止反應，加入2 mL 0.2% a-萘胺溶液，2 mL 1%磺胺溶液，搖勻靜置顯色15 min，測定反應液在520 nm的吸光度。根據回歸方程計算反應液中所產生的亞硝態氮總量[10]。

2) 亞硝酸還原酶(Nitrite reductase，NiR)活性測定：參考Scheible W R等[11]的方法。反應液(1.35 mL)包括：0.05 mL 10 mmol的亞硝酸鈉溶液、1 mL pH=7.5的100 mmol磷酸鈉緩沖液、0.05 mL甲基紫精溶液、蒸餾水0.05 mL，最后加酶提取物0.15 mL。反應液中加入0.05 mL連二亞硫酸鈉鹽(50 mg/mL)后在25 ℃下反應30 min。取0.2 mL反應液加蒸餾水稀釋至6.7 mL，加入1%(w/v)鹽酸萘乙二胺1.5 mL和1.8 mL 1%磺胺。15 min后，測定反應液在540 nm處吸光率。

3) 谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase，GS)活性測定：提取緩沖液：0.05 mol/L Tris-HCl，pH=8.0，含2 mmol/L DTT、2 mmol/L MgSO4、0.4 mol/L蔗糖；反應混合液A：0.1 mol/L pH=7.4 Tris-HCl緩沖液，含20 mmol/L谷氨酸鈉鹽，80 mmol/L Mg2+，20 mmol/L半胱氨酸和2 mmol/L EGTA；反應混合液B(含鹽酸羥胺，pH=7.4)：反應混合液A再加入80 mmol/L鹽酸羥胺；顯色劑：0.2 mol/L TCA，0.37 mol/L FeCl3和0.6 mol/L HCl的混合液；40 mmol/L ATP溶液(臨用前配制)。樣品冰浴中加入提取緩沖液研磨勻漿，4 ℃，15 000 g離心20 min，所得上清液為粗酶液。取0.7 mL粗酶液加入1.6 mL反應混合液B和0.7 mL ATP溶液混勻，并置于37 ℃下保溫。30 min后加入1 mL顯色劑搖勻，5 000 g下離心10 min，取上清液測定其在540 nm處的吸光值。以加入1.6 mL反應混合液A的溶液作為對照[12]。

4) 谷氨酸合成酶(Glutamate synthase，GOGAT)活性測定：提取液配制以及粗酶液提取方法采用上述GS酶活性測定中的方法進行。反應混合液含0.4 mL 20 mmol/L L-谷氨酰胺、0.1 mL 10 mmol/L的KCl、0.5 mL 20 mmol/L a-酮戊二酸、0.2 mL 3 mmol/L NADH和0.3 mL粗酶液，用25 mmol/L的Tris-HCl緩沖液(pH=7.6)補足1.5 mL。于340 nm處每隔30 s測定反應液消光值，取光密度穩定減小的一段來衡量酶活性[13]。

5) 谷氨酸脫氫酶(Glutamate dehydrogenase，GDH)活性測定：提取液為0.2 mmol/L Tris-HCl(pH=8.2)；反應液A：1.6μmol/L NAD+360μmol/L Tris-HCl(pH=9.0)；反應液B：1.6μmol/L NAD+60μmol/L L-谷氨酸+360μmol/L Tris-HCl(pH=9.0)。植物材料冰浴中加入提取液研磨勻漿，取1 mL酶提取液加入2 mL反應液B，以反應液A為對照，反應溶液在340 nm處比色，每隔30 s記錄一次消光值，直至讀數穩定[14]。

1.2.5 氮代謝物質含量測定

可溶性蛋白質含量測定：采用考馬斯亮藍法[15]；游離氨基酸總量測定：采用茚三酮顯色法[16]。

1.2.6 數據分析和處理方法

實驗數據通過Excel 2010軟件進行處理，用SPSS 19.0軟件方差分析和相關性分析(p<0.05)。

2 結果與分析

2.1 種衣劑對氮代謝酶編碼基因表達的影響

選擇植物氮代謝途徑中的關鍵酶：硝酸還原酶(NR)、亞硝酸還原酶(NiR)、谷氨酸合成酶(GOGAT)、谷氨酰胺合成酶(GS)和谷氨酸脫氫酶(GDH)為研究對象，首先利用熒光定量PCR法分析種衣劑處理后氮代謝途徑關鍵酶編碼基因的表達變化，研究種衣劑對氮代謝途徑酶編碼基因表達的影響。結果(圖1)顯示：高濃度的吡蟲啉處理后小麥植株中氮代謝途徑相關基因表達量均顯著下降；而低濃度的吡蟲啉處理后NR基因表達量除了小麥萌發第9天明顯提高，其余時期降低。結果說明吡蟲啉種衣劑會降低氮代謝途徑關鍵酶的基因的表達量，而且這種抑制作用和種衣劑的使用濃度呈現正相關關系。

注：“*”和“**”分別表示差異顯著(p<0.05)和極顯著(p<0.01)。下同。圖1 吡蟲啉對小麥氮代謝基因表達量的影響

圖2 吡蟲啉對小麥氮代謝關鍵酶活性的影響

圖3 吡蟲啉包衣對小麥氮代謝產物含量的影響

2.2 種衣劑對氮代謝酶活性的影響

在確定吡蟲啉種衣劑影響植株氮代謝基因表達的基礎上，采用生理生化方法測定了硝酸還原酶(NR)、亞硝酸還原酶(NiR)、谷氨酸合成酶(GOGAT)、谷氨酰胺合成酶(GS)和谷氨酸脫氫酶(GDH)活性。結果(圖2)顯示：低濃度吡蟲啉種衣劑處理后NR和GS酶活性增加，而NiR、GOGAT和GDH酶活性降低，高劑量吡蟲啉種衣劑處理后NR、NiR和GDH酶活性降低；而GS和GOGAT酶活性反而增加。從結果看出，不同濃度種衣劑對氮代謝酶活性的影響不同，不同酶活性對種衣劑的相應也不相同。

2.3 種衣劑對氮代謝產物的影響

為了揭示種衣劑對氮代謝水平的影響，分析了種衣劑對植物氮代謝產物：游離氨基酸含量和可溶性蛋白質含量的影響。從圖3可看出，吡蟲啉種衣劑處理后小麥植株中可溶性蛋白質和游離氨基酸含量顯著增加，而且隨著與種衣劑的使用濃度呈正相關關系。

3 結論與討論

氮代謝是植物生命活動中最基本的代謝體系之一，主要作用包括無機氮的同化、還原以及含氮有機化合物的合成、轉化等。植物生長初期，正是器官建成時期，吸收氮的能力強，以氮素代謝為主。因此研究種衣劑對植物幼苗生長時期氮代謝的影響可以揭示種衣劑對植物生長發育影響的生理基礎，具有重要的意義。前期研究發現，吡蟲啉種衣劑可推遲小麥種子萌發，影響小麥幼苗生長[7]。因此，本研究擬研究吡蟲啉種衣劑對小麥氮代謝的影響，揭示吡蟲啉種衣劑對小麥影響產生的生理機制。

植物體內NR和NiR分別催化NO3-還原為NO2-和NO2-還原為NH4+，最終NH4+參與到蛋白質的合成。NR和NiR酶是氮代謝的關鍵酶，其活性的調控在氮同化控制中起著重要作用，并顯著影響植物生長發育[17]。本研究發現，吡蟲啉種衣劑處理后，小麥植株中亞NiR基因表達和酶活性均顯著下降。谷氨酰胺合成酶(GS)是氮代謝過程中的關鍵酶，能催化NH4+和谷氨酸合成谷氨酰胺，是高等植物氮素同化的主要途徑[18]，過量的NH4+對植物機體有毒害作用，而GS活性增強可以促進銨態氮與谷氨酸合成谷氨酰胺，進一步合成谷氨酸，使NH4+同化加強，是植物的一種自我保護機制[19-20]。結果顯示，處理后GS基因表達下降，但是催化活性卻顯著增加，可能是在種衣劑處理下，需要加速氮代謝，從而加強植物的自我保護。同時，GDH活性呈增加趨勢，可以促進NH4與a-酮戊二酸轉化成谷氨酸，有助于氮代謝的進行[21]。本研究發現，種衣劑處理后，植株中GDH基因表達量和酶活性均顯著降低。

游離氨基酸在植物細胞中以游離態存在，可被合成氨基酸和蛋白質，是植物氮運輸的主要形式[22]。用游離氨基酸含量可部分反映氮轉化的生理變化，游離氨基酸含量減少，可促使氮的轉化向蛋白質合成的方向發展[19]。可溶性蛋白是小麥氮同化物累積的主要形式和最終產物，因此在同化物代謝的過程中起著重要作用[23]。本研究發現，吡蟲啉種衣劑處理后，小麥植株中游離氨基酸和可溶性蛋白質含量均顯著增加，而且呈現出濃度效應。說明吡蟲啉種衣劑處理后，小麥植株中氮代謝加快，氮素消耗加速，如果不及時補充氮源，則會影響小麥的生長和發育。