引發對老化大麥籽粒吸水量及活力的影響

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(石河子大學農學院，新疆 石河子 832003)

種子在貯藏過程中會發生一系列生理生化方面的劣變，這種劣變導致其萌發率降低及幼苗的生長能力減弱甚至消失。種子引發不僅可以不同程度地提高種子的發芽特性，還可以修復種子的老化[1]。研究表明，不同類型的種子引發方式能夠提高種子發芽率和出苗率[2-3]。

聚乙二醇具有無毒、粘度大、溶液通氣性差，不通透過細胞壁等優點，可降低萌發過程中水分進入種子的速度，因而成為最常用的引發劑。目前，聚乙二醇引發已應用于小麥[4]、大豆[5]等植物老化種子的研究中。另外，Ca2+作為偶聯胞外信號與細胞內生理生化反應的第二信使，是植物代謝和發育的主要調控者。用CaCl2溶液浸種能有效提高水稻幼苗的抗鹽性，而且其光合速率、根系活力、葉綠素含量等均高于水浸種[6]。目前，用CaCl2浸種已廣泛應用于桔梗[7]、黃秋葵[8]、煙草[9]、丹參[10]等的研究。總之，種子引發技術是目前國際上先進的種子處理技術之一，已廣泛應用到玉米、水稻、小麥等多種糧食作物和蕓薹屬、胡蘿卜、芽菜、黃瓜、茄子、洋蔥、西瓜、番茄等蔬菜等作物上[11]。研究認為，引發具有促進種子萌發、提高出苗整齊度和增加活力的作用，但引發效果和引發條件的要求往往因植物種或品種甚至種批的不同而差異很大[12]。

目前關于大麥老化種子引發的研究少有報道。本試驗采用人工加速老化法對大麥種子進行處理，比較不同引發方式對老化大麥籽粒吸脹曲線和活力的影響，篩選出最優引發試劑，為大麥種子貯藏和在生產實踐中活力的保持提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

以大麥品種甘啤4號和0416-1為實驗材料，于2017年7月采自石河子大學實驗站，保存于-20 ℃種子庫。

1.2 種子人工老化處理

采用廖樂等[13]的高溫高濕法，略作修改。挑選大小均勻一致的大麥籽粒，用0.1% HgCl2消毒5～10 min后沖洗干凈，在40 ℃、相對濕度為80%條件下分別在培養箱中處理0，3.5，6.5，9.5 d，重復3次。用30 cm×40 cm白瓷盤盛滿蒸餾水置于人工智能培養箱的頂層和底層，培養箱中間放3層架子并事先鋪有尼龍網，將箱內溫度調至40 ℃，平衡1 d，使培養箱內的溫濕度穩定在40 ℃、80%相對濕度，然后將種子單層平鋪于事先鋪有尼龍網的培養箱的架子上進行老化(老化所用培養箱內部、白瓷盤、架子以及尼龍網等均需預先消毒)。處理完成后，取出種子在室溫下風干，待其含水量降至原始水平即可進行相關實驗。

1.3 種子引發

取上述老化處理后的種子適量分別放于燒杯中，加入事先配制好的20%PEG溶液浸泡，置于25 ℃恒溫培養箱中浸泡24 h，取出后用蒸餾水沖洗干凈，室溫下回干備用，同時以蒸餾水浸泡的種子為對照。1%CaCl2溶液引發同上。

1.4 發芽特性指標的測定

1.4.1 發芽方法

根據國際種子檢驗協會標準發芽方法[14]，在20 ℃，相對濕度60%條件下，采用發芽盒紙上法，將經過老化、引發及未經過處理的大麥種子用蒸餾水沖洗3～4次，并用干凈濾紙吸干種子表面浮水待用。在事先消毒好墊有3層濾紙(11 cm×16 cm)的發芽盒(16 cm×19 cm)中加入15 mL蒸餾水，將消毒好的大麥籽粒均勻擺放在濾紙上，每盒50粒，每處理重復3次，然后在20 ℃人工氣候培養箱內培養，前3天暗培養，第4天起按照14 h/10 h的光暗比進行光照培養，每天統計種子發芽數，第7天統計結束。

1.4.2 測定內容

測定大麥種子的發芽勢、發芽率、發芽指數和活力指數。

發芽勢(%)=(第4天發芽種子數/供試種子總數)×100%;

發芽率(%)=(第7天發芽種子數/供試種子總數)×100%;

發芽指數(GI)=∑Gt/Dt;

活力指數(VI)=GI×S。

式中:Dt為相應的發芽天數，Gt為與Dt相對應的不同時間(t)的發芽數，S為發芽7天幼苗的鮮重(g)。

1.5 吸脹曲線的測定

將老化0，3.5，6.5，9.5 d及用不同引發劑引發后的大麥種子按照測定發芽率的方法分別進行吸脹處理，每個處理3次重復，每隔6 h用無菌濾紙吸去種子表面的水，測定種子鮮重，并統計發芽數，連續測定72 h。以吸水量為縱坐標，吸脹時間為橫坐標，繪制吸脹曲線。

1.6 相對電導率測定

種子浸出液相對電導率的測定采用電導率儀法[15]并作部分修改。每個大麥品種種子25粒，重復3次，先用去離子水沖洗3次，濾紙吸干種子表面殘留水分。將種子放入200 mL燒杯中，加125 mL去離子水，用保鮮膜封住燒杯口在20 ℃光照培養箱中放置24 h，取出燒杯搖動使溶液均勻一致，測定浸泡液電導率d1，然后將燒杯置于100 ℃水浴鍋中煮沸30 min，用電導率儀測定浸出液電導率d2。種子浸出液相對電導率(%)=(d1/d2)×100%。

1.7 MDA含量測定

MDA含量的測定采用硫代巴比妥酸法，用南京建成試劑盒進行測定。

1.8 數據處理與統計分析

試驗數據利用Excel軟件進行原始數據的處理，SPSS軟件進行多重比較和相關性分析。多重比較采用Duncans法進行，結果以平均值(標準偏差)表示。

2 結果與分析

2.1 老化及引發后大麥籽粒吸脹曲線的變化

2.1.1 老化及引發后甘啤4號籽粒吸脹曲線的變化

由圖1可知，未老化甘啤4號大麥籽粒在吸脹72 h內，隨吸脹時間的延長籽粒吸水量呈快-慢-快的變化趨勢，在最初6 h吸水量變化最大，6～30 h吸水量持續增加但幅度不大，30～72 h吸水量持續增加。老化6.5 d和老化9.5 d種子吸水量變化趨勢基本相似但都小于對照和老化3.5 d。對照和老化3.5 d的大麥籽粒在30～72 h吸水量依舊迅速增加但始終對照吸水量最高，即隨老化程度加深，種子吸水量越來越少，說明老化影響了種子的正常吸水。

圖1 老化對大麥種子吸脹曲線的影響

由圖2可以看出，甘啤4號大麥籽粒經20%PEG溶液引發后，種子吸水量均有增加的趨勢且顯著高于未引發時種子的吸水量，在最初6 h吸水量變化最大，與圖1比較引發后30～72 h吸水持續增加且趨勢顯著，尤其對老化6.5 d和老化9.5 d的大麥籽粒效果最明顯，而且PEG引發對中活力(老化6.5 d)的大麥籽粒吸水效果最顯著，其吸水量一直處于最高水平。隨吸脹時間持續增加至72 h，吸水量達到最大，并且引發后3種不同老化程度的大麥種子吸水量達到相同水平，說明20% PEG引發促進了種子的吸水。

圖2 PEG引發對老化大麥種子吸脹曲線的影響

由圖3可知，經1%CaCl2溶液引發后，大麥籽粒在最初6 h吸水量變化最大，與圖1比較引發后30～72 h吸水持續增加且趨勢顯著，與圖2中PEG引發相比較，CaCl2溶液引發對老化3.5 d的大麥籽粒效果最顯著，其吸水量一直處于最高水平。對中活力(老化6.5 d)的大麥籽粒來說，顯然CaCl2溶液引發要比PEG引發效果好。

圖3 CaCl2引發對大麥種子吸脹曲線的影響

2.1.2 老化及引發后0416-1大麥籽粒吸脹曲線的變化

由圖4可知，對大麥品種0416-1的籽粒在最初6 h吸水量變化最大，而后隨吸脹時間的增加吸水量也在持續增加。對照和老化3.5 d籽粒的吸水量最高，其次為老化6.5 d，吸水量最低的為老化9.5 d的大麥籽粒，表明隨籽粒老化程度加深其吸水量也在逐漸減小，說明老化影響了種子的正常吸水。

圖4 老化大麥種子吸脹曲線的影響

由圖5可知，0416-1大麥種子在最初6 h吸水量變化最大。與圖4相比，經PEG引發后，種子吸水量有增加的趨勢，尤其對中活力(老化6.5 d)的種子效果更顯著，說明PEG引發促進了種子的吸水量。當吸脹時間達到72 h時，老化3.5 d和9.5 d的種子吸水量趨于相同。

由圖6可知，0416-1大麥籽粒在最初6 h吸水量變化最大，經1%CaCl2溶液引發后籽粒吸水量有增加的趨勢，尤其高活力(老化3.5 d)的大麥種子吸水量顯著增加，6.5 d種子吸水量次之，9.5 d種子吸水量最低，由此可知，種子活力越高受損傷的程度越小，引發效果越好。

圖5 PEG引發對老化大麥種子吸脹曲線的影響

圖6 CaCl2引發對0416-1吸脹曲線的影響

2.2 引發對大麥老化種子發芽率的影響

隨老化程度加深，2個大麥品種的發芽率均顯著降低(表1)。老化6.5 d和9.5 d的甘啤4號大麥種子，經PEG引發后發芽率顯著升高，尤其中活力(老化6.5 d)的大麥種子發芽率從71.33%升高至96.00%；同樣經CaCl2引發后，對老化3.5 d和6.5 d的大麥籽粒發芽率顯著升高，但低活力(老化9.5 d)的籽粒發芽率反而降低。對甘啤4號來說，PEG引發比CaCl2引發發芽率更高，效果更好。對0416-1來說，經PEG引發后發芽率較未引發顯著升高，尤其對低活力(老化9.5 d)的大麥種子差異更顯著；同樣經CaCl2引發后，不同處理的發芽率都比未引發種子的發芽率高，對0416-1來說，CaCl2引發比PEG引發發芽率更高。

表1 引發對大麥老化種子發芽率的影響

品種老化天數(d)未引發20% PEG引發1% CaCl2引發甘啤4號097.33a(3.05)97.33a(3.05)97.33a(3.05)3.588.00bcd(4.00)93.33abc(5.77)95.33abc(5.03)6.571.33e(3.05)96.00ab(3.46)87.33cd(4.16)9.572.00e(2.00)92.00abc(3.46)70.00e(5.29)0416-1093.33abc(2.30)93.33abc(2.30)93.33abc(2.30)3.593.33abc(4.16)94.00abc(4.00)94.00abc(5.29)6.583.33d(3.05)96.00ab(3.46)94.67abc(4.16)9.561.33f(8.32)88.67bcd(1.15)90.67abcd(1.15)

注：不同字母表示在 0.05 水平不同老化天數和不同處理間差異顯著，括號內數字為標準偏差。下同。

2.3 引發對大麥老化種子發芽勢的影響

隨老化程度加深，2種大麥品種發芽勢均顯著降低(表2)。對甘啤4號而言，經PEG引發后，老化6.5 d和9.5 d的大麥種子相比較未引發的發芽勢顯著升高，尤其對老化6.5 d的大麥種子其發芽勢從68.67%迅速升高至94.00%；同樣經CaCl2引發后，老化3.5 d和6.5 d的大麥籽粒發芽勢顯著升高，尤其對老化6.5 d的籽粒影響顯著，但老化9.5 d的籽粒其發芽勢反而降低。對甘啤4號來說，PEG引發比CaCl2引發其發芽勢效果更好。對0416-1來說，經PEG引發后其發芽勢較未引發顯著升高，尤其對老化9.5 d的大麥種子其差異更顯著；同樣經CaCl2引發后，不同處理的發芽勢都比未引發種子的發芽勢高；同樣對0416-1來說，PEG引發比CaCl2引發的發芽勢更高。

表2 引發對大麥老化種子發芽勢的影響

品種老化天數(d)未引發20% PEG引發1% CaCl2引發甘啤4號096.00a(3.46)96.00a(3.46)96.00a(3.46)3.586.67abc(4.16)90.67abc(8.32)95.33a(5.03)6.568.67d(1.15)94.00abc(2.00)83.33c(1.15)9.571.33d(1.15)90.67abc(4.16)64.67d(7.57)0416-1092.67abc(1.15)92.67abc(1.15)92.67abc(1.15)3.592.67abc(5.03)92.67abc(5.03)93.33abc(6.42)6.584.00bc(14.42)94.67ab(3.05)92.67abc(5.03)9.554.67e(8.08)89.33abc(1.15)85.33abc(3.05)

2.4 引發對大麥老化種子發芽指數的影響

隨老化程度加深，2種大麥品種的發芽指數均顯著降低(表3)。經PEG和CaCl2引發后，甘啤4號大麥種子發芽指數顯著升高，尤其老化6.5 d的大麥種子，發芽指數分別從11.35%迅速升高至15.89%和14.89%，對甘啤4號來說，PEG引發比CaCl2引發的發芽指數更高一點。經PEG和CaCl2引發后，0416-1大麥種子發芽指數顯著升高，老化9.5 d的大麥種子經不同引發后其發芽指數分別從9.5%迅速升高至15.35%和14.72%；同樣，對0416-1來說，PEG引發比CaCl2引發的發芽指數更高。

表3 引發對大麥老化種子發芽指數的影響

品種老化天數(d)未引發20% PEG引發1% CaCl2引發甘啤4號017.07a(0.83)17.07a(0.83)17.07a(0.83)3.514.91bcd(0.94)15.74abcd(1.48)16.03abc(1.04)6.511.35e(0.81)15.89abcd(0.63)14.21cd(0.82)9.511.17e(0.50)15.59abcd(0.99)11.33e(1.32)0416-1016.73ab(1.15)16.73ab(1.15)16.73ab(1.15)3.516.01abc(1.12)16.77ab(1.26)16.11abc(1.39)6.513.89d(1.11)16.15abc(0.75)15.51abcd(1.10)9.59.50e(1.57)15.36abcd(0.92)14.72bcd(0.94)

2.5 引發對大麥老化種子活力指數的影響

由表4可知，隨老化程度加深，甘啤4號活力指數先降低后升高，經PEG引發后活力指數隨老化程度加深持續降低，但均比未引發時的活力指數要高，尤其對老化6.5 d的種子影響最大，其活力指數從4.88升高至7.03。同樣經CaCl2引發后，活力指數先升高后降低，但均比相同程度下未引發時的活力指數要高。對于0416-1，隨老化程度加深其活力指數先升高再降低，經PEG引發后活力指數隨老化程度先升高后降低再升高，但均比未引發時要高，尤其對老化9.5 d的種子影響顯著，其活力指數從4.65升高至7.26。同樣經CaCl2引發后，其活力指數先升高后降低，但均比相同程度下未引發時的活力指數要高，尤其對老化9.5 d的種子影響顯著，其活力指數從4.65升高至7.10。

表4 引發對大麥老化種子活力指數的影響

品種老化天數(d)未引發20% PEG引發1% CaCl2引發甘啤4號07.42abc(1.61)7.42abc(1.61)7.42abc(1.61)3.56.75bcd(0.23)7.16abc(0.91)7.53abc(0.31)6.54.88e(0.61)7.03abc(0.21)5.77de(0.40)9.55.06e(0.51)6.76bcd(0.46)5.12e(0.24)0416-107.53abc(0.33)7.53abc(0.33)7.53abc(0.33)3.58.03ab(0.51)8.08a(0.45)8.08a(0.58)6.56.30cd(0.11)7.06abc(0.62)7.16abc(0.64)9.54.65e(0.69)7.26abc(1.00)7.10abc(0.84)

2.6 引發對大麥老化種子相對電導率的影響

脂質過氧化產物丙二醛和相對電導率(REC)是衡量膜損傷程度的重要指標，相對電導率越大說明內含物外滲的速率越快、內含物外滲量增加，故而種子的損傷程度越高。由圖7和圖8可知，隨老化時間延長種子電導率都呈快速升高的趨勢，說明老化后其內含物外滲的速率增快、內含物外滲量逐漸增多，從而使浸出液相對電導率逐漸升高，也說明隨老化程度加深種子受損傷程度也增加，待種子充分吸脹后，內含物外滲的速率放緩趨于穩定，電導率基本平衡。經PEG和CaCl2引發后電導率均逐漸減小，說明這2種引發溶液減小了與老化大麥種胚細胞之間的水勢差，降低了水分進入種胚細胞的速度，從而使內含物外滲的速率放緩、內含物外滲量逐漸減少，故而推測引發緩解了種子的損傷。PEG引發對這2種老化種子的修復效果更好。

圖7 引發對相對電導率的影響

圖8 引發對相對電導率的影響

2.7 引發對大麥老化種子丙二醛含量的影響

丙二醛(MDA)是脂質過氧化產物，MDA含量升高，說明細胞膜系統受到損傷。MDA含量通常作為衡量活性氧對細胞造成傷害的一個重要指標[16]。由表5可知，對甘啤4號，隨老化程度加深其丙二醛含量呈先降低后升高的趨勢，即老化達到9.5 d時種子內部已發生一定程度的損傷。經PEG引發后其丙二醛含量呈先升高后降低的趨勢，尤其老化9.5 d時與對照相比差異顯著，從5.84 nmol/mg降至3.06 nmol/mg。同樣經CaCl2引發后其丙二醛含量呈先升高后降低再升高的趨勢。對0416-1，隨老化程度加深其丙二醛含量呈先升高后降低的趨勢，老化達6.5 d時其丙二醛含量最高，為6.42 nmol/mg。經PEG引發后其丙二醛含量呈先升高后降低的趨勢，尤其老化6.5 d時與對照相比差異顯著，從6.42 nmol/mg降至5.43 nmol/mg。同樣經CaCl2引發后其丙二醛含量呈先升高后降低再升高的趨勢，老化達9.5 d時其丙二醛含量最高，為4.87 nmol/mg。但總的來說，引發后其丙二醛含量均比對照要低，說明引發對老化損傷還是有一定的修復作用。

表5 引發對大麥老化種子MDA含量的影響

品種老化天數(d)未引發20% PEG引發1% CaCl2引發甘啤4號03.07abc(2.13)3.07abc(2.13)3.07abc(2.13)3.52.65bc(0.10)3.27abc(0.46)4.69abc(2.52)6.53.27abc(1.79)3.64abc(1.39)2.10c(0.65)9.55.84ab(1.41)3.06abc(1.93)3.95abc(1.57)0416-103.49abc(2.16)3.49abc(2.16)3.49abc(2.16)3.53.64abc(2.22)3.89abc(0.66)4.51abc(2.46)6.56.42ab(1.22)5.43abc(2.59)4.44abc(1.51)9.54.13abc(1.17)3.86abc(2.07)4.87abc(1.76)

2.8 大麥種子在老化和引發過程中部分生物學指標間的相關性分析

由表6可知，大麥種子在老化和引發過程中，發芽率、發芽勢、發芽指數和活力指數之間兩兩呈顯著正相關關系，MDA與相對電導率呈負相關關系。而作為衡量膜損傷程度的重要指標，MDA和電導率與以上4個發芽特性指標之間均呈負相關關系。

表6 大麥種子在老化和引發過程中部分生物學指標間的相關性分析

品種指標GRGPGIVIMDA甘啤4號GP0.992**GI0.991**0.982**VI0.957**0.962**0.969**MAD-0.353-0.276-0.384-0.211REC-0.473-0.422-0.409-0.422-0.0950416-1GP0.987**GI0.974**0.979**VI0.911**0.910**0.956**MAD-0.057-0.032-0.157-0.307REC-0.274-0.293-0.316-0.243-0.156

注：**表示在0.01水平上相關(雙側)。GR表示發芽率；GP表示發芽勢；GI表示發芽指數；VI表示活力指數；MDA表示丙二醛；REC表示相對電導率。

3 討 論

種子引發技術也稱滲透調節，是一項控制種子緩慢吸水和逐步回干，從而提高種子發芽率的播前處理技術[17]。本研究表明，隨老化程度加深，大麥種子內部發生了不同程度的劣變，主要表現在發芽率、發芽勢、發芽指數和活力指數均顯著降低，老化種子的電導率和MDA含量均顯著升高，這與Nagel M等[18]的研究觀點相同。經20%PEG和1%CaCl2滲透處理24 h后，2種大麥品種籽粒吸水量、發芽率、發芽勢、發芽指數和活力指數與對照比較均顯著提高，經引發的大麥幼苗的長勢顯著優于未經處理的幼苗。引發后2種大麥品種老化種子的電導率和MDA含量均顯著降低，這與王彥榮等[19]的研究結果相似。電導率可以反映植物受到逆境脅迫時的損傷程度，是反映細胞膜透性和完整性的一個綜合指標，PEG引發使大豆種子保持了正常的膜透性和完整性，而使種子具有適應冷脅迫的能力，從而減輕了冷傷害的程度[20]。有研究表明，種子引發的實質是在限制種子吸水速率的條件下使種子膜系統得到較好修復并提前啟動萌發所需的物質代謝，說明引發不僅能預防種子的吸脹損傷，還能緩解甚至修復其老化損傷。

聚乙二醇作為一種高分子滲透調節劑，其特殊的結構特征可減慢種子萌發初始吸水速度[21]，在萌發前使種子有足夠的時間進行修復[22]，減少種子在低溫吸脹時電解質和有機物的滲漏[23]；研究表明，PEG滲透調節處理顯著提高葫蘆種子的發芽勢、發芽率和活力指數，降低種子外滲電導率[24]，種子老化會導致其細胞膜透性增大，膜完整性降低，從而造成種子活力下降；小麥種子用PEG引發處理后，電導率的降低證明了引發處理可以維持種子細胞膜的完整性，降低種子的電導率，修復種子的老化損傷，并顯著提高其活力水平[25-28]。這與本研究結果相同。研究發現，PEG引發對老化種子的修復作用體現在兩個方面：一方面，PEG引發提高了其超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)及谷胱甘肽還原酶(GR)等抗氧化酶的活性，從而緩解老化過程的脂質過氧化損傷，表現為MDA含量減少[29-30]；另一方面，適當濃度的PEG引發可以啟動種子細胞內的保護機制，降低其膜系統的損傷，增強膜系統的修復，從而提高種子萌發能力，促進幼胚的生長[31]。

除了大分子物質(如PEG)外，小分子物質(如CaCl2)也常用作引發劑，徐金金等研究表明，1% CaCl2引發后，2種不結球白菜的發芽勢、發芽率、發芽指數和活力指數顯著高于對照和其他處理[32]。這與本研究結果相同。CaCl2引發顯著降低小麥種子發芽時間，幼苗的苗長度、幼苗的鮮重和干重顯著升高，在出苗試驗中，所有引發處理均不影響幼苗的出苗率、平均出苗時間和干重[33]。

高溫高濕人工加速老化的大麥種子含水量普遍較高，與引發溶液之間的水勢差較小，水分進入種胚細胞的速度也相對較慢，所以一般不會引起吸脹損傷。20% PEG和1%CaCl2溶液減小了引發溶液與老化大麥種胚細胞之間的水勢差，降低了水分進入種胚細胞的速度。因此，適當滲透勢的PEG和CaCl2溶液引發可以啟動老化大麥種子體內的保護機制，降低種子吸脹過程中膜系統的損傷，增強膜系統的修復，從而提高大麥種子萌發能力。

目前，關于引發的研究最重要的課題是滲透調節的機制問題，而且關于引發的分子機理仍不清楚。隨著生物技術的發展，從細胞和分子水平上探討引發機理，尋找與引發效應相關的生理、生化、生物物理和分子標記，以作為控制種子吸濕活動和提高種子質量的工具，這一領域的研究有廣闊的發展前景。本研究僅從生理生化的角度研究了不同引發的效應，對引發的分子機理還有待深入的研究。

4 結 論

種子引發顯著提高了2個大麥品種種子的吸水量、發芽率、發芽勢、發芽指數和活力指數，經引發的大麥幼苗的長勢顯著優于未經處理的幼苗，引發后2種大麥品種老化種子的電導率和MDA含量均顯著降低，說明引發不僅可以提高老化種子的發芽特性，還能夠預防種子的吸脹損傷進而修復其老化損傷。20%PEG溶液引發效果略好。