貴州小麥糯性基因多重 PCR 體系的優化

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(1.貴州省農業科學院旱糧研究所，貴陽 550006； 2.貴州大學生命科學院，貴陽 550025)

普通小麥(TriticumaestivumL.)胚乳中含有直鏈和支鏈2種淀粉。其中顆粒結合淀粉合成酶Ⅰ(Granules-bound starch synthaseⅠ,GBSS Ⅰ)，又稱Wx蛋白，由蠟質基因控制合成，是禾谷類作物控制直鏈淀粉合成的關鍵酶。普通六倍體小麥(Triticum aestivum L.，AABBDD)含有3個蠟質基因位點：位于染色體7 AS的Wx-A1、4 AL的Wx-B1和 7 DS的Wx-D1[1-2]。后來研究發現了3種Wx基因的缺失型Wx-A1b、Wx-B1b和Wx-D1b，則相對的野生型基因型則為Wx-A1a、Wx-B1a和Wx-D1a。小麥中Wx蛋白控制著小麥籽粒中直鏈淀粉的合成，其Wx基因的缺失使小麥胚乳中直鏈淀粉的含量下降，因此，小麥胚乳表現出糯性[3-4]。研究發現，任何一種Wx蛋白亞基的缺失都能改變小麥的直鏈淀粉合成，3個Wx基因蛋白亞基全缺失的小麥稱為全糯小麥，1個或2個Wx基因蛋白亞基缺失，會造成直鏈淀粉的合成受到影響，支鏈淀粉含量升高，稱為部分糯小麥[5]。而全糯小麥幾乎不含直鏈淀粉或者含量極低(<1%)[6]。

目前國內外學者已開發出鑒定3個糯質基因的STS標記和SSR標記，并且Wx-A1基因的STS標記已成功用于澳大利亞優質面條[7-10]。劉迎春等[11]在揚麥10與關東107的雜交后代中，利用引物MAG 264和MAG 269分別篩選出Wx-A1、Wx-D1缺失型的部分糯性小麥，并得出MAG 264、MAG 269分別是Wx-A1、Wx-D1兩者的專一性PCR標記。任麗娟等[12]用SSR標記，同時對小麥的3個Wx基因位點進行檢測，在雜交后代中獲得4株全糯小麥。鄧萬洪等[13]利用序列標志位點標記技術，對中國核心小麥種質品種進行分析，并用SDS-PAGE進行驗證，篩選出了Wx-B1基因缺失型小麥。近年來，利用基于PCR的多重PCR技術對基因進行檢測的分子標記技術不斷被應用在小麥的糯性檢測中，盧龍斗等[14]通過在一個PCR體系中加入2對引物，分別對3個糯質基因進行擴增，成功在矮抗與糯麥1902的后代群體中，分離得出Wx-A1、Wx-D1突變型各2株，Wx-B1突變型3株，同時缺失Wx-B1，Wx-D1基因的2株，Wx-A1，Wx-B1兩者都缺失的1株，3個基因都缺失的1株。這些利用多重PCR檢測小麥糯質基因的實驗。為后來學者采用多重PCR檢測小麥糯質基因奠定了基礎。

表1 引物序列及其擴增片段大小

基因名稱引物名稱引物序列(5'→3')擴增片段大小(bp)參考文獻Wx-D1a/bMAG269FCGAGCGGCTACTCAAGAGCMAG269RGGCGGTCATCTGTCATTTCC1400/800劉迎春[11]Wx-B1a/bBRDCTGGCCTGCTACCTCAAGAGCAACTBFDLCTGACGTCCATGCCGTTGACGA-/425Nakamura et al[20]Wx-A1a/bMAG264FCCAAAGCAAAGCAGGAAACCMAG264RTACCTCGGAGATGACGCTGG336/317劉迎春[ 11]

糯小麥中支鏈淀粉含量高，糊化起始溫度低，黏度大，具有良好的抗老化特性，制作耐冷藏的速凍食品，以及延長面包類制品的貨架壽命[15]；糯小麥淀粉凝膠表面酥脆、淀粉糊透明度、凍融穩定性好[16]；糯小麥淀粉比普通小麥淀粉具有高含量的蛋白質和濕面筋，而且糯小麥淀粉還具有延伸性好、持水性能力強、其面團的粘性大等優點[17]；在造紙業和食品工業中具有很大的應用前景[18]。糯小麥不僅可以作為主食食用，而且在釀酒上也有很大的應用前景，趙國軍等[21]對糯小麥的釀酒特性進行研究，得出糯小麥的出酒率比普通小麥和高粱的出酒率都高，因此具有很高的經濟價值[16-19]。

本研究利用多重PCR結合田間農藝性狀調查的方法對渝糯麥5號、自育品系4 th 6008以及雜交F3代的72個單株的糯性蛋白基因進行鑒定，利用與小麥糯質基因(Wx-A1a，Wx-B1a和Wx-D1a)連鎖的3個特異分子標記MAG 264、BDFL/BRD、MAG 269對其小麥品種(系) 中Wx 蛋白亞基分布的多態性；驗證貴州小麥品種(系)Wx基因特異分子標記的有效性；利用有效的分子標記構建Wx基因多重 PCR 體系，為分子標記輔助選擇提供快速有效的方法，提高小麥淀粉品質評價和糯小麥選育的效率。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本實驗采用小麥系為實驗材料，由貴州省農業科學院小麥課題組提供。

1.2 多重PCR引物

通過搜索文獻，篩選MAG 269、MAG 264和BRD/BFDL對Wx基因位點進行標記，其引物序列和PCR預期擴增條帶如表1，引物序列由上海生物工程科技有限公司合成。

1.3 DNA的提取

種子發芽進行幼苗培養，取新鮮葉片，采用CTAB法提取總基因組，略做修改，提取的DNA 樣品稀釋到100 ng/μL備用。

1.4 Wx-A 1、Wx-B 1、Wx-D 1位點的單重PCR鑒定

PCR反應體系(20μL)：10×Buffer 2.0μL，2.5 mM dNTP Mixture 0.4μL，每種引物各0.2，0.5，0.7μL，Template DNA 2.2μL，rTaqDNA Polymerase 0.11μL，補ddH2O 20μL。PCR擴增程序：94 ℃ 預變性5 min，94 ℃變性45 s，退火溫度每個循環降低0.4 ℃，35個循環，即從第1次循環時的66 ℃降到最后1次循環的52 ℃，然后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。 PCR擴增在MJ Research PTC-200型PCR儀上完成。取4μL擴增后的產物在8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行檢測，l×TBE緩沖液，100 W恒功率下，電泳1 h分離PCR產物，銀染，銀染后凝膠成像系統檢測、照相。

1.5 多重PCR擴增及電泳檢測

3個Wx蛋白亞基基因標記的多重PCR體系及反應條件參照張曉科設定的條件，進一步進行優化，反應體系及條件如表2所示。PCR擴增程序采用touchdown體系，退火溫度每個循環降低0.2 ℃，44個循環，即從第2次循環時的66 ℃降到最后1次循環的57.4 ℃，然后72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。PCR擴增在MJ Research PTC-200型PCR儀上完成。取4μL擴增后的產物在8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行檢測，l×TBE緩沖液，160 V恒壓下，電泳1～1.5 h分離PCR產物，銀染，銀染后凝膠成像系統檢測、照相。

圖1 MAG 264、BRD/BFDL、MAG 269單重PCR圖

表2 多重PCR反應和電泳條件

項目名稱多重PCR體系基因標記Wx-A1、Wx-B1、Wx-D1PCR反應體系25μLrTaq DNA Polymerase0.5μL2.5mM dNTP Mixture2.3μL10μmol/μL引物濃度0.68/0.5/0.68PCR擴增條件預變性94℃,5min,變性94℃,50s退火66～57.4℃(-0.2℃/第2個循環),50s延伸72℃,1min 20s循環數44最后延伸72℃,7min電泳條件Native-PAGE(%)8電壓(V)160時間(h)1～1.5

2 結果與分析

2.1 單重PCR的檢測

野生型Wx-A1a基因序列比突變型Wx-A1b的核酸序列多19 bp。利用 Wx-A 1位點特異性引物在隨機選取的樣本中僅擴增出317 bp帶，不能擴出 336 bp條帶。從圖1-A可看出，在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠中，條帶較清晰，分辨率較好。

Wx-B 1位點特異性引物BRD/BFDL,從野生型材料Wx-B 1 a 位點擴增出425 bp條帶，卻不能從突變型材料Wx-B1b基因型中擴增出 425 bp條帶。從圖1-B可看出，雖然PCR反應條件簡單，但未擴增出425 bp的條件，說明該材料為Wx-B 1的缺失型植株。

由于劉迎春設計的突變型Wx-B 1 b 基因的3′序列缺失位置設計引物，因此，在野生型Wx-B 1 a植株中擴增片段為1 400 bp，在突變型Wx-B 1 b植株中擴增片段大小為800 bp。從圖1-C可看出，在隨機選取的樣本中均能擴增出800 bp的條帶，且條帶清晰，說明該植株為Wx-D 1的缺失型植株。

2.2 多重PCR檢測結果

Wx-A 1位點在野生型(Wx-A1a) 中擴增出336 bp 條帶，在突變型(Wx-A1b)中擴增出317 bp 條帶；Wx-B 1位點擴增結果會出現多個條帶，425 pb條帶是判斷是否含有Wx-B 1突變的糯質基因Wx-B1b，在突變型(Wx-B1b)中Wx-B1基因擴增出425 bp條帶，而在野生型中擴增不出該條帶。若擴增出1 400 bp條帶，則為Wx-D 1野生型，800 bp條帶則為Wx-D 1突變型(圖3)；Wx-D 1位點標記在野生型(Wx-D1a)中擴增出1 400 bp 的條帶，在突變型(Wx-D1b)中擴增出 800 bp 條帶。在圖3多重PCR體系隨機檢測的 10個材料中(圖 2)，1，3，5，6，8，9號泳道都擴增出了800 bp 條帶，說明Wx-D 1 位點為Wx-D1b等位基因，其余產生1 400 bp條帶，為野生型Wx-D1a。同時，1，3，5，6，8，9號材料都能擴增出371 bp、425 bp、800 bp三條帶，為缺失型的全糯小麥。2，4，7，10號泳道同時擴增出317 bp、425 bp的條帶，為Wx-A 1、Wx-B 1的缺失型。

圖2 糯性基因多重PCR體系優化圖

2.3 小麥基因位點

a為野生型，b為突變型；Wx-A 1野生型的基因型：A- ，Wx-A 1野生型的基因型為aa ；Wx-B 1野生型的基因型：B-，Wx-B 1突變型的基因型：bb；Wx-D 1野生型的基因型：D-，Wx-D 1突變型的基因型：dd。

表3 F3代72株基因位點統計結果

編號Wx-A1Wx-B1Wx-D1基因型表現型1bbbaabbdd全糯2bbbaabbdd全糯3bbaaabbD-部分糯4abbA-bbdd部分糯5abbA-bbdd部分糯6bbaaabbD-部分糯7bbbaabbdd全糯8bbaaabbD-部分糯9aabA-B-dd部分糯10bbbaabbdd全糯11bbbaabbdd全糯12bbaaabbD-部分糯13bbaaabbD-部分糯14bbbaabbdd全糯15abbA-bbdd部分糯16abbA-bbdd部分糯17bbbaabbdd全糯18abbA-bbdd部分糯19bbaaabbD-部分糯20bbaaabbD-部分糯21bbbaabbdd全糯22bbaaabbD-部分糯23bbaaabbD-部分糯24bbbaabbdd全糯25bbbaabbdd全糯26abbA-bbdd部分糯27abaA-bbD-部分糯28abbA-bbdd-部分糯29bbbaabbdd全糯30bbbaabbdd全糯31bbbaabbdd全糯32bbbaabbdd全糯33bbbaabbdd-全糯34abbA-bbdd部分糯35abbA-bbdd部分糯36bbaaabbD-部分糯37abaA-bbD-部分糯38abbA-bbdd部分糯39abbA-bbdd部分糯40bbbaabbdd全糯41abaA-bbD-部分糯42abbA-bbdd部分糯43abbA-bbdd部分糯

續表3

編號Wx-A1Wx-B1Wx-D1基因型表現型44bbbaabbdd全糯45bbbaabbdd全糯46bbbaabbdd全糯47bbaaabbD-部分糯48bbbaabbdd全糯49bbbaabbdd全糯50bbbaabbdd全糯51bbbaabbdd全糯52bbbaabbdd全糯53bbbaabbdd全糯54bbbaabbdd全糯55aAbA-B-dd部分糯56bbbaabbdd全糯57abbA-bbdd部分糯58bbbaabbdd全糯59bbaaabbD-部分糯60bbbaabbdd全糯61bbbaabbdd全糯62bbaaabbD-部分糯63abbA-bbdd部分糯64bbbaabbdd全糯65abaA-bbD-部分糯66bbbaabbdd全糯67baaaaB-D-部分糯68bbaaabbD-部分糯69aabA-B-bb部分糯70abbA-bbdd部分糯71bbbaabbdd全糯72bbbaabbdd全糯

2.4 F3代群體中糯質小麥頻率

對72個F3代分離群體中有34(47.22%)株小麥在800 bp、425 bp、317 bp同時擴增出三條帶，即Wx-A1、Wx-B1、Wx-D1同時缺失型的全糯小麥；擴增出317 bp、425 bp片段的有14株(19.44%)Wx-A1、Wx-B1缺失型；同時擴增出800 bp、425 bp的Wx-B1、Wx-D1缺失型的有16株(22.22%)；只擴增425 bp的Wx-B1基因缺失型的4株(5.56%)和只擴增800 bp的Wx-D1基因缺失型的3株(4.17%)以及只擴增出316 bp的Wx-A1基因缺失型的1株(1.39%)。

3 討 論

普通小麥中直鏈淀粉含量為22%～25%，籽粒中直鏈淀粉和支鏈淀粉含量的比例受不同的Wx蛋白亞基的影響，Wx 蛋白亞基通常采用2 D-SDS-PAGE 和1 D-SDS-PAGE進行電泳檢測分離，但操作繁瑣，難度大。后續出現改良后的1 D-SDS-PAGE 分離并分析 Wx 蛋白的亞基構成，簡便、快速，適用于小麥育種中對 Wx 蛋白類型的初步篩選。同時，由于Wx-B 1 和 Wx-D 1 亞基的分子量、等電點相近，運用SDS-PAGE不易區分。Wx蛋白分子標記的開發與應用，不僅提高育種效率，而且使分子標記輔助育種在小麥育種中得到應用。目前國內外已開發了大量的SSR、STS- PCR和分別檢測WxA1和Wx-D1a的 CAPS 和 dCAPS標記，梁榮奇等[21]應用SSR標記對江蘇白火麥回交改良群體中個體進行輔助選擇，得到了含Wx-D1b的7 D單體，為將來進一步改良糯性小麥的農藝性狀提供廣泛的遺傳材料。

宋建民等[22]根據Wx-A1、Wx-B1和Wx-D1的3個位點基因序列和變異情況分別設計了PCR引物，但設計的 Wx-B 1位點引物，以及劉迎春等[11]建立專一檢測Wx-A 1位點和Wx-D 1位點的PCR標記MAG 264和MAG 269。

本研究利用與小麥糯質基因(Wx-A1a，Wx-B1a和Wx-D1a)連鎖的3個特異分子標記MAG 264、BDFL/BRD、MAG 269，對F3代分離群體進行分子標記，擴增產物條帶清晰易辯，操作簡單，效率高，并且，由于Wx-A 1和 Wx-D 1采用的是共顯性標記，能夠清晰的明確雜交后代的基因型，避免了顯引物擴增中出現的假陰性問題。而鑒定Wx-B 1位點采用的是顯性標記，避免因片段缺失出現誤差。并且，Wx基因在對應的標記位點都有相對應的擴增產物。因此，適用于Wx基因共分離的分子標記技術，結合傳統育種手段，對雜交后代材料中的糯性基因進行跟蹤選擇，選育綜合性狀優良、適合貴州生態氣候、可用于生產推廣的糯性小麥新材料，加快新品種選育效率。