綠山楂種子內源抑制物成分的初步鑒定

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(1.南京林業大學南方現代林業協同創新中心, 江蘇 南京 210037；2.山西省林業種苗管理總站, 太原 030012)

綠山楂(CrataegusviridisL.)是薔薇科山楂屬落葉小喬木，原產于美國德克薩斯州的東部[1]。大多數山楂樹枝上有許多枝刺，但綠山楂樹枝上很少或幾乎沒有刺。夏季，綠山楂樹葉呈黃綠色到深綠色，秋天變成紫紅色、青銅色或金色。綠山楂通常于早春開花，有明顯的白色花朵，花5 瓣。果實桔色至紅色，可保留到第2年春季，具有較高的觀賞價值和經濟價值[2]。綠山楂生長速度中等，喜好潮濕、肥沃且排水良好的土壤，適應能力較強，易栽培，耐修剪，可在我國的東北南部、華北、江蘇一帶栽植，是良好的庭院栽培樹種。

綠山楂一般采取種子繁殖，但是其種子具有明顯的休眠特性，一般需要經過兩冬一夏的層積才能解除休眠，這給綠山楂的播種育苗生產帶來了很多不便。國內外關于種子休眠機理的研究較多。Albertus Magus早在13世紀初便提出種子推遲發芽與抑制物質有關[3]。自1975年Khan[4]提出“三因子學說”以來，各種各樣的植物內源抑制物不斷被發現。不同植物中含有的內源抑制物不盡相同，張艷杰等[5]對南方紅豆杉[Taxuschinensisvar.mairei(Lemee et I’ev1.)] 種子中存在的抑制物進行了研究，證實了南方紅豆杉種子的胚乳、中種皮和內種皮中均含有抑制種子萌發和幼苗生長的物質。王小平、王九齡研究了白皮松(PinusbungeanaZuce.)種子中的內源抑制物，發現種子各部位抑制作用由強到弱的順序為：外種皮、內種皮、胚乳；他們還發現白皮松種子中ABA類物質不是引起種子休眠的唯一抑制劑，休眠是由多種抑制物共同作用的，因此萌發抑制劑具有多樣性的特點[6]。趙敏等的研究表明，刺五加果實及其外果皮、中果皮、種子中均含有一定活性的內源抑制物質，且外果皮、中果皮、種子中所含的內源抑制物質對白菜籽萌發的抑制活性高于對白菜幼根生長的抑制活性[7]。關于山楂屬植物種子休眠機理的研究有很多，楊曉玲等對山楂屬不同樹種種子中抑制物的活性進行了比較研究，結果表明：種子各部位如種殼、種皮和種仁中均含有抑制物質，且不同種類的山楂種子解除休眠的難易程度不同[8]；他們還發現，山楂種子層積過程中抑制物質的活性也逐漸降低[9]。朱梅玲等認為，酚類物質是山楂種子發芽的抑制物，層積過程中種子內所含酚類物質含量也逐漸降低[10]。苗衛東等在研究不同種類野生山楂種子休眠解除方法時發現，濃硫酸可以使山楂種殼均勻變薄，重量減輕，種孔堵塞物消除，種皮透氣、透水性增加，從而促進山楂種子的萌發[11]。還有研究認為，GA有促進山楂種子萌發的作用，而ABA對種子萌發有抑制作用[12-13]。張培玉等研究了在不同采收期、室溫干藏和層積過程中山楂種子GA3、IAA、ABA含量變化規律及其與休眠的關系，認為GA3、IAA對打破休眠、促進萌發有一定作用，而ABA則是抑制種子萌發的重要因素[14]。李秉真等研究了山楂種子的休眠與后熟期間內源激素的變化，研究顯示，層積時間越長，山植種子中ABA含量越低，IAA/ABA值持續增加，因此ABA對山楂種子萌發有一定的抑制作用，低含量的ABA不會影響種子的萌發[15]。

盡管不同學者對山楂屬植物休眠原因開展了一系列的研究，但對造成綠山楂休眠抑制物的種類還不清楚。本研究擬通過系統溶劑分離法對綠山楂種子的內源抑制物質進行萃取，并對各有機相萃取液進行生物測定，同時結合GC-MS技術鑒定各有機相分離的內源抑制物的成分，以期為綠山楂種子內源抑制物及其休眠機理研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

綠山楂種子從美國購買后置于4 ℃冰箱中保存備用。供試白菜籽(矮腳黃)購于南京金盛達種子公司，純度≥95.0%，發芽率≥85%。

1.2 試驗方法

1.2.1 千粒重測定

采用百粒法測定，隨機數取綠山楂種子各100 粒×8 重復，用千分之一電子天平分別稱重并做好記錄，根據ISTA 規則(2013)[16]計算其標準差和千粒重。

1.2.2 綠山楂種子抑制物的初步分離

稱取綠山楂種子100 g，磨碎成粉后，置于1 000 mL的錐形瓶中，分幾次加入1 500 mL 80%的甲醇溶液，參考張艷杰[17]的方法，得到甲醇浸提液，加入蒸餾水定容至300 mL。用系統溶劑法[18]對上述甲醇浸提液進行初步分離(見圖1)。將粗提液先后分離為5個組分：石油醚相、乙醚相、乙酸乙酯相、甲醇相及水相。然后將各有機相溶液分別置于旋轉蒸發儀RE-3000上進行濃縮蒸發，最后將各有機相定容為50 mL，置于4 ℃冰箱中保存備用。

圖1 綠山楂種子中抑制物質提取流程圖

圖2 乙醚相提取物的離子流程圖

1.2.3 不同相的生物活性測定

將上述各相提取的溶液進行生物活性測定。隨機數取白菜籽50粒，分別在各相的2 mL溶劑中浸泡3 h。隨后在直徑9 cm的培養皿中鋪上濾紙，分別加入各內源抑制物浸提液5 mL。待其自然晾干后，放入對應相處理后晾干的白菜籽，以清水處理作為對照。將試驗材料置于25 ℃光照培養箱中發芽，每個處理重復3次。計算發芽率[19]和發芽指數[20]。

1.2.4 綠山楂種子各有機相化學成分的鑒定

取各有機相相同體積的浸提液在旋轉蒸發儀RE-3000內減壓濃縮蒸干，然后用相應的有機溶劑溶解、定容至2mL，即得到各有機相提取物的濃縮樣品。各濃縮樣品在色譜-質譜(GC-MS)聯用儀進行成分鑒定，儀器型號為：美國安提綸6890 N/5973 N(中國林業科學院林產化學研究所分析測定中心)。氣相色譜條件依據韓寶瑞等[21]的方法，最后由計算機控制的庫存信號檢查各個成分的質譜圖并與標準譜圖核對。

1.2.5 數據分析

試驗數據采用Microsoft Office Excel 軟件以及SPSS 22.0軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 種子千粒重的測定結果與分析

千粒重是反映種子大小與飽滿程度的重要指標[22]。本次采用百粒法測定綠山楂種子的千粒重為21.56 g，標準差為0.002 8，變異系數為1.30%，因此綠山楂種子個體之間重量變化不大。

2.2 綠山楂種子中各分離相的生物活性測定

白菜種子發芽快速、整齊，故常被用來驗證各分離相提取物質的生物活性。本次各分離相對白菜籽發芽的影響見表1。

初期的預試驗表明，石油醚、乙醚、乙酸乙酯和甲醇4種有機溶劑自身對白菜籽發芽均沒有顯著影響，因此本研究中浸提液處理后白菜籽發芽率、發芽指數的變化均是由浸提液中的內源抑制物引起的。從表1可以看出：與對照組相比，綠山楂種子的乙醚相、乙酸乙酯相、甲醇相均對白菜籽發芽有顯著抑制作用，并且乙醚相的抑制作用最強，發芽率從對照的93.3%下降到0.7%，降低了92.6%；其次為甲醇相，發芽率下降到4.0%，較對照降低了89.3%；再次為乙酸乙酯相，發芽率下降到58.0%，較對照降低了35.3%。白菜籽在石油醚相和水相的發芽率雖有小幅下降，但與對照相比下降不顯著。

表1 綠山楂種子中各分離相對白菜籽發芽的影響

處理發芽率(%)發芽指數發芽指數較對照組下降的百分數(%)對照93.3±1.3a18.6±0.3a0石油醚相91.3±1.8a18.6±0.5a0乙醚相0.7±0.7c0.1±0.1c99.5乙酸乙酯相58.0±7.6b10.5±1.5b43.5甲醇相4.0±1.2c0.6±1.2c96.8水相92.7±1.3a17.1±1.0a8.1

綠山楂種子各分離相溶液處理白菜種子后，其發芽指數與對照組相比也有一定的降低。其中，石油醚相、水相的發芽指數較對照無顯著差異；乙醚相、甲醇相的發芽指數較對照組分別下降了99.5%、96.8%。白菜籽的發芽率、發芽指數結果均表明：綠山楂種子的甲醇、乙醚、乙酸乙酯分離相中可能存在一些發芽抑制物質。

2.3 綠山楂種子主要內源抑制物組分成分的鑒定

圖2為綠山楂種子乙醚相提取物經GC-MS分析的離子流程圖，共分離出63個峰。

通過質譜系統檢索并與標準譜圖進行核對，離子流程圖中相似度大于85%的化合物的結果見表2。本次乙醚相中鑒定出的主要的有機化合物含量占總峰面積的74.1%，相對含量較多的為：未知物質1(18.1%)，beta-谷甾醇(13.0%)、2，6-二叔丁基對甲苯酚(12.0%)、1，2-苯并異噻唑-3-酮(5.9%)、亞油酸(5.2%)等。

表2 綠山楂種子主要內源抑制物組分成分分析

有機溶劑相序號 序號 時間 中文名 英文名 分子式 分子量 相對含量 (%) 乙醚相17.6582,2,4,6,6-五甲基庚烷2,2,4,6,6-pentamethyl-HeptaneC12H261700.7219.686香蘭素VanillinC8H8O31523.1322.6112,6-二叔丁基對甲苯酚2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenolC15H24O22012.0426.225丁香醛3,5-Dimethoxy-4-hydroxyben zaldehydeC9H10O41822.0528.033未知14.9631.975棕櫚酸甲酯Methyl hexadecanoateC17H34O22701.9735.322亞油酸9,12-Octadecadienoicacid,methyl esterC19H34O22945.2835.437順式-十八碳烯酸methyl 11-octadecenoateC19H36O22963.0946.737芥酸酰胺ErucylamideC22H43NO3374.31054.8171,2-苯并異噻唑-3-酮1,2-Benzisothiazolin-3-oneC7H5NOS1515.91157.489beta-谷甾醇beta-SitosterolC29H50O41413.01259.937未知1Hopa-22(29)-ene3β-ol18.1合計74.1甲醇相110.662愈創木酚GuaiacolC7H8O21242.0214.9124-羥基苯硫酚4-MercaptophenolC6H6OS1262.7317.274對乙烯基愈瘡木酚2-Methoxy-4-vinylphenolC9H10O21501.3418.325紫丁香醇2,6-DimethoxyphenolC8H10O31542.5519.623香蘭素(E)-2-甲氧基-4-(1-丙烯基苯酚)VanillinC8H8O31521.4620.969Phenol,2-methoxy-4-(1Z)-1-propen-1-yl-C10H12O21642.3721.0424-羥基-3-甲氧基芐醇4-Hydroxy-3-methoxybenzyl alcoholC8H10O31541.0824.0463-羥基-4-甲氧基苯甲酸3-Hydroxy-4-methoxybenzoic acidC8H8O41681.3925.0653,4,5-三甲氧基苯酚3,4,5-TrimethoxyphenolC9H12O41841.61026.221丁香醛3,5-Dimethoxy-4-hydroxybenzaldehydeC9H10O41822.71127.1534-烯丙基-2,6-二甲氧基苯酚Phenol,2,6-dimethoxy-4-(2-propen-1-yl)-C11H14O31941.81227.743未知12.11327.9034-羥基-3-甲氧基肉桂醛2-Propenal,3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-C10H10O31.71428.0655-乙酰氨甲基-4-氨基-2-甲基嘧啶4-((1E)-3-Hydroxy-1-propenyl)-2-methoxyphenolC8H12N4O18018.01532.897二苯基乙酸甲酯Benzeneacetic acid,a-phenyl-, methyl esterC15H14O22262.51633.399未知24.11744.911未知33.2合計52.2乙酸乙酯相120.991(E)-2-甲氧基-4-(1-丙烯基苯酚)Phenol,2-methoxy-4-(1Z)-1-propen-1-yl-C10H12O21642.7222.424未知1Tridecane, 7-methyl-C14H301982.4326.222丁香醛3,5-Dimethoxy-4-hydroxybenzaldehydeC9H10O41821.9427.889松柏醛2-Propenal,3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-C10H10O31785.2527.996未知237.4630.038未知34.5744.922醌茜素1,2,5,8-tetrahydroxy anthraquinoneC14H8O62723.5846.734芥酸酰胺ErucylamideC22H43NO3371.7合計59.3石油醚相131.977棕櫚酸甲酯Methyl hexadecanoateC17H34O22702.7235.330亞油酸9,12-Octadecadienoicacid, methyl esterC19H34O22948.3335.444順式-十八碳烯酸methyl11-octadecenoate Phthalic acid,C19H36O22963.9443.244鄰苯二甲酸單酯mono-(2-ethylhexyl) esterC16H22O42782.7546.745油酸酰胺OleamideC18H35NO2813.6657.537γ-谷甾醇Stigmast-5-en-3-ol,(3b,24S)-C29H50O41422.5759.997未知124.9861.966未知21.2合計69.8

甲醇相中的離子流程圖共得到129峰，按上述原則鑒定出的主要有機化合物含量占總峰面積的52.2%(表2)，相對含量較大的幾種物質為：5-乙酰氨甲基-4-氨基-2-甲基嘧啶(18.0%)、未知物質2(4.1%)、未知物質3(3.2%)、丁香醛(2.7%)等(表2)。乙酸乙酯相中的離子流程圖共得到75峰，按上述原則鑒定出的主要有機化合物含量占總峰面積的59.3%，相對含量較大的幾種物質為：未知物質2(37.4%)、松柏醛(5.2%)、未知物質3(4.5%)、醌茜素(3.5%)等。石油醚相中離子流程圖共得到91峰，通過質譜系統檢索并與標準譜圖進行核對，相似度大于85%的主要有機化合物含量占總峰面積的69.8%。其中相對含量占優勢的為未知物質1(24.9%)、γ-谷甾醇(22.5%)、亞油酸(8.3%)、順式-十八碳烯酸(4.0%)、油酸酰胺(3.6%)等。

3 結論與討論

3.1 抑制物的生物活性測定

張艷杰等采用系統溶劑法分離了南方紅豆杉種皮和胚乳中的抑制物質，并進行了抑制活性測定，結果發現，甲醇相的抑制性幾乎達到100%，從而猜測甲醇相中含有較多的抑制物[17]；韓寶瑞等在證明西洋參果實中存在發芽抑制物的同時，發現乙醚相和甲醇相的抑制效果大于其他各組分[23]；孫曉剛等在研究鳳丹(Paeoniaosstii)種子胚乳中內源抑制物質活性及其成分組成時發現，鳳丹胚乳各有機溶劑萃取液對白菜種子發芽率和幼苗高生長、根長生長均有不同程度的抑制作用，但抑制物質活性存在一定差異，乙醚相的抑制效果最強，其次是甲醇相[24]。在本研究中，綠山楂種子各有機相的生物測定結果(表1)表明，各分離組分對白菜種子的發芽均有一定的抑制作用，抑制作用最強的是乙醚相，其次是甲醇相。這與前人研究結果基本一致。

3.2 內源抑制物對種子萌發的影響

已有研究發現，造成種子休眠的內源抑制物種類較多，主要包括ABA 、醛類、有機酸、氫氰酸、芥子油、香豆素類、氨以及脂肪酸等。郭廷翹等研究發現，水曲柳(FraxinusmandshuricaRupr)種子中的ABA以及油酸、亞油酸等長鏈脂肪酸都可以抑制該種子的萌發[25]。棕櫚酸甲酯也已被證實對玉米、黃豆、黃瓜、水稻4種作物胚根、胚芽的生長有顯著抑制作用[26]。酚類物質常存在于某些植物的器官中，多數酚類物質對種子萌發也會起抑制作用。楊曉玲等研究表明，層積后尚未解除休眠的山楂種子，種仁和種皮中酚類物質雖有下降，但降低不明顯，而解除休眠后的種子中酚類物質下降明顯，因此該種子休眠的解除可能與酚類物質含量的下降有關[27]。還有一些研究發現：羥基苯甲酸、香草酸、香豆素等會明顯抑制春小麥胚根和胚芽生長[28]，這也可能是抑制種子萌發的物質。

本研究中綠山楂種子的乙醚相、甲醇相、乙酸乙酯相中也被檢測出上述被證實過的某些內源抑制物，如酚類物質、亞油酸、棕櫚酸甲酯、蒽醌類、醛類和酰胺類等，且相對含量較多。因此推測，這可能是造成綠山楂種子休眠的原因之一,也有可能是幾種物質相互作用從而導致種子休眠。本次石油醚相中檢測到的主要化合物為有機酸類、酰胺類和醇類等物質，以往的研究表明，這些物質中有的也是造成種子休眠的原因，但本次石油醚相的生物活性測定結果(表1)表明，該相的抑制活性較弱，這可能是由于這些物質在該相中的含量較低造成的。由于GC-MS技術只能確定某一物質的相對含量，不能確定其真正的含量，因此今后有必要繼續對造成綠山楂種子休眠的內源抑制物的含量進行測定。另外，這些內源抑制物的中濃度還需要通過購買標樣的方式進行確定，以最終確定哪些內源抑制物是造成綠山楂種子生理休眠的重要原因。本次在各相中或多或少都存在一些未知物質，可能是計算機圖庫未比對出這些物質，也可能是幾種物質的混合物沒有完全分離，具體原因還有待進一步研究。根據生物活性測定(表1)，水相對白菜籽發芽也具有一定的抑制作用，但由于儀器的限制，水相中具體的抑制物質也未能確定出來。