茶樹花粉離體萌發條件優化及活力快速檢測

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(貴州省農業科學院茶葉研究所 貴陽 550006)

茶樹(Camelliasinensis)為重要經濟飲料作物，是世界3種無酒精飲料主要作物之一。茶樹為雌雄同株且自交親和性低的一種蟲媒植物，由于茶樹本身特性、開花季節、環境和花粉活力等因素的影響，茶樹結實率往往較低[1]，而較低的結實率會影響育種效率。福鼎大白茶(C.sinensiscv.Fuding-dabaicha)是國家級優良茶樹品種之一，往往被作為雜交育種的優良親本材料，目前利用福鼎大白茶作為親本選育的優良品種有福云6號、福云7號、黔湄809、鄂茶1號等[2]。

花粉作為父本遺傳信息傳遞的載體，是雜交育種實施的基本材料[3-4]。常規育種常會遇到氣候不宜、不同品種花期不遇或雄性不育等問題[5]。因此，測定花粉活力，對于茶樹雜交育種中的人工授粉、花期不遇的解決具有重要意義。

目前，對茶樹花粉活力研究已有報道，如陳暄等[1]以龍井長葉花粉為材料，得到花粉最適的培養基為0.01%(100 mg/L)H3BO3+0.05%(500 mg/L)Ca(NO3)2+5%PEG-4 000+5%麥芽糖，25 ℃恒溫培養1 h，萌發率為82.24%，花粉管生長長度為492μm；楊盛美等[6]以100 g/L蔗糖+1%瓊脂的固體培養基，25 ℃恒溫培養4 h，研究了10個茶種花粉的萌發率為9.2%～79.1%；許林等研究認為，臺茶12號和福鼎大白茶的花粉離體萌發的最適培養基及條件是300 mg/L Ca(NO3)2+200 mg/L MgSO4+100 mg/L KNO3+100 mg/L H3BO3+10%蔗糖+1%瓊脂，最適pH值為5.4，適宜萌發溫度16～21 ℃培養24 h[7]。這些研究都是用離體萌發法測定花粉活力，因為品種不同，培養基組分差異等原因，所得結果則不盡相同。茶樹花粉活力少見有染色法測定茶樹花粉活力的報道。染色法是一種快速檢測花粉活力的方法，為提高雜交育種結實率，雜交育種前對花粉活力的快速檢測尤其重要。花粉離體萌發法是測定花粉活力最直觀可靠的方法，本研究以福鼎大白茶花粉為材料，考慮不同濃度的蔗糖、硼酸、硝酸鈣，采用正交試驗設計優化茶樹花粉離體萌發培養基；通過離體萌發法、TTC染色法的對比，探討茶樹花粉活力的快速測定方法。對茶樹花粉的活力進行系統研究，以期建立有效、快速的花粉活力檢測方法，為后期開展茶樹花粉貯藏活力檢測和雜交育種提供依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

以種植于貴州省農業科學院茶葉研究所茶樹種質資源圃的5年生福鼎大白茶為研究對象，取其新鮮花粉作為試驗材料。

1.2 方 法

1.2.1 試驗設計

2017年11月，以福鼎大白茶花粉為材料，考慮不同濃度的蔗糖、硼酸、硝酸鈣，采用正交試驗設計優化茶樹花粉離體萌發培養基；通過離體萌發法、TTC染色法的對比，探討茶樹(C.sinensis)花粉活力的快速測定方法。選擇晴天09：00～11：00時，采集生長發育良好、含苞待放的花朵，及時攤放在陰涼干燥處，待24 h后花粉成熟時，輕輕打開花瓣，將花粉從花朵上輕輕抖落在硫酸紙上，除去雜質，放入棕色玻璃瓶中并充分振蕩搖勻，用封口膜密封，貯藏于4 ℃冰箱備用。試驗溶液均用蒸餾水配制，其濃度均為終濃度，配制溶液的pH值均為5.5±0.1，每處理均制作4個玻片，即4個重復。

試驗一：花粉離體萌發法[8]

采用L9(34)正交試驗篩選花粉離體萌發條件(表1)，以期篩選出最優的離體萌發條件。

表1 茶樹花粉離體萌發正交試驗設計因素和水平

水平因素蔗糖(g/L)硼酸(mg/L)硝酸鈣(mg/L)110010010021501501503200200200

試驗二：氯化三苯基四氮唑(TTC)法[9]

采用2.5，5，10 g/L(m/v)3種濃度，以期篩選出最優的TTC染色法。

1.2.2 培養方法

試驗一采用凹槽載玻片，不需加蓋蓋玻片。試驗二使用的是光片載玻片，且制片時需要加蓋蓋玻片。往載玻片滴一小滴配制溶液，用牙簽挑取少許花粉，輕拍手腕，將花粉抖落于培養基表面，當其表面呈微黃色即可。將制好的玻片放入鋪有濕潤濾紙的培養皿中，然后置于25 ℃恒溫培養箱中培養。

1.2.3 觀 測

試驗一：培養24 h后用顯微鏡(尼康 Nikon ECLIPSE 80 i，日本生產，下同)觀察花粉萌發情況，放大倍數為100倍，每個載玻片隨機選取5個視野(每個視野花粉在100粒以上)，統計每個視野花粉粒總數和萌發的花粉數，花粉萌發以花粉管長度大于花粉直徑為標準；每個視野隨機抽取10粒已萌發的花粉，測定花粉管長度。試驗二：每隔30 min用顯微鏡觀察花粉活力，放大倍數為100倍，每個載玻片隨機選取5個視野(每個視野花粉在100粒以上)，染為紅色的花粉活力強，淡紅色的次之，無色者為沒有活力的花粉或不育花粉。預試驗觀察發現，2 h后染為紅色和淡紅色的花粉數量基本穩定，則試驗2 h后停止觀察，統計時將染為紅色和淡紅色的花粉計為有活力花粉。

1.3 數據處理

計算每個視野有活力的花粉粒數占總花粉粒數的百分率，花粉活力均用百分數表示，進而求算每個重復的平均值。用SPSS 23.0軟件對數據進行統計分析；對百分數類型數據轉換為反正弦數據再進行分析。

2 結果與分析

2.1 花粉離體培養法最優培養基篩選

2.1.1 3個因素對花粉萌發率的影響

采用L9(34)正交試驗通過花粉離體萌發測定花粉萌發率，由表2可知，蔗糖不同濃度對花粉離體萌發率影響較少，最佳的濃度為150 g/L的蔗糖；而硼酸和硝酸鈣對花粉萌發率的影響顯著(p<0.05)，硼酸的最優濃度為第二水平(150 mg/L)，其次是第一水平(100 mg/L)，但兩者差異不顯著，而硝酸鈣的第一水平和第二水平濃度的差異也不明顯，對花粉萌發率影響最好的是第一水平(100 mg/L)。因此，就花粉萌發率而言，3個因素的最優組合是A2B2C1。

表2 3個因素的不同水平對花粉離體萌發率的影響

水平因素蔗糖(A)硼酸(B)硝酸鈣(C)180.5683.48A86.35A284.2186.11A83.62A380.775.88B75.5B

注：同列數值不同大、小寫字母分別表示差異極顯著(p<0.01)和差異顯著(p<0.05)。下同。

2.1.2 3個因素對花粉管生長長度的影響

蔗糖、硼酸、硝酸鈣3個因素不同水平對花粉管生長長度的影響較大，蔗糖的不同濃度間對花粉管生長長度影響顯著(p<0.05)，最優水平是A2，其次是A1，兩者差異不顯著；而硼酸和硝酸鈣不同濃度的影響達到了極顯著水平(p<0.01)(見表3)，硝酸鈣的C1、C2水平與C3水平差異極顯著，最優水平是C1，硼酸的B1、B2、B33個水平兩兩之間差異都達到了極顯著水平，其中最佳的是B1，說明硼酸對花粉管長度影響起主要作用。如表3所示，最優組合是A2B1C1。

表3 3個因素的不同水平對花粉管生長長度的影響

水平因素蔗糖(A)硼酸(B)硝酸鈣(C)1249.21ab375.62A278.04A2267.79a225.78B258.55A3216.93b132.53C197.35B

2.1.3 3個因素對花粉管長度的影響

由表4可知，蔗糖、硝酸鈣對最長花粉管長度的影響為顯著差異，而硼酸的影響為極顯著差異，但3個因素的最優水平都是水平1，則最優組合是A1B1C1。A1與A2、C1與C2之間差異不顯著，但分別與A3、C3達到極顯著差異，而硼酸的3個水平間彼此差異極顯著。

表4 3種因素的不同水平對最長花粉管長度的影響

水平因素蔗糖(A)硼酸(B)硝酸鈣(C)1547.8a765.44A563.6a 2533.19a450.82B507.24a 3414.87b279.59C425.01b

2.1.4 優化水平組合的確定

綜合3個測定指標的分析結果，且花粉萌發率是花粉萌發效果的主要指標。蔗糖、硼酸、硝酸鈣3個因素中，硼酸對花粉萌發率、花粉管生長長度、最長花粉管長度的影響結果均達到了極顯著水平；而硝酸鈣對花粉萌發率、花粉管生長長度的影響達到極顯著水平，對最長花粉管長度的影響達到顯著水平；而蔗糖對花粉萌發率影響不顯著，對花粉管長度和最長花粉管長度差異影響顯著。因此，3個因素對茶樹花粉體外萌發效果的影響排序為B(硼酸)>C(硝酸鈣)>A(蔗糖)，最優水平組合為A2B2C1，即150 g/L蔗糖+150 mg/L硼酸+100 mg/L硝酸鈣，其次是100 g/L蔗糖+100 mg/L硼酸+100 mg/L硝酸鈣，3種方法比較時用100 g/L蔗糖+100 mg/L硼酸+100 mg/L硝酸鈣。

2.2 TTC法對花粉活力檢測

在TTC染色法試驗中，隨著TTC的濃度增加，被染為紅色和淡紅色的花粉粒增加，其中10 g/L TTC的著色花粉粒最多，達83.17%(1 h時)。除了2.5 g/L TTC和5 g/L TTC隨著培養時間增加而著色花粉粒增加，2.5 g/L TTC在0.5 h的著色花粉粒與1，1.5，2 h的著色花粉粒有顯著差異，而5 g/L TTC和10 g/L TTC在4個時間段的著色花粉數差異不顯著，且10 g/L TTC染色受時間的影響較小，1 h的著色花粉粒最多為83.17%，1.5 h和2 h的著色花粉數卻較1 h的少。TTC這種現象可能說明在2.5 g/L TTC和5 g/LTTC時，TTC底物不能滿足氧化還原反應，隨著時間的增加，更多的TTC被還原為TTF，則著色花粉粒增多；而在10 g/L TTC時，TTC底物充足，在短暫的時間內，過量的TTC即可通過花粉的呼吸作用的氫還原為TTF，因此，4個時間段著色花粉數差異不顯著，且與花粉離體萌發法結果相近，說明用10 g/L TTC染色法快速檢測花粉活力效果最佳，且該濃度染色時間以1 h即可(圖1)。

注：不同大寫字母表示同一時間不同濃度間差異極顯著(p<0.01)，不同小寫字母表示同一濃度不同時間差異顯著(p<0.05)。圖1 不同TTC濃度對茶樹花粉活力的影響

注：a為花粉離體培養液1培養生長情況，放大100倍；b為10 g/L TTC法30 min染色情況，放大100倍。圖2 不同方法的茶樹花粉活力測定比較

2.3 花粉活力檢測方法比較

如圖2所示，利用顯微鏡觀察，10 g/L TTC法對茶樹花粉的染色效果明顯，視野內可清晰區分出花粉的紅色、淡紅色以及未著色花粉；花粉離體萌發法培養花粉，在顯微鏡下可明顯區分出萌發花粉粒，是一種直觀可靠的方法。

如表5所示，離體萌發法(100 g/L蔗糖+100 mg/L硼酸+100 mg/L硝酸鈣)的測定結果最高，為90.04%， TTC法染色為83.17%。2種方法測定的花粉活力差異不顯著(p>0.05)，因離體萌發法和TTC法統計時易分辨，且重復性好，則可用這2種方法測定茶樹花粉活力(表5)，且TTC法可用于快速檢測茶樹花粉活力。

表5 2種方法測定茶樹花粉活力比較

方法花粉活力(%)花粉離體萌發90.04aTTC法83.17a

3 討 論

花粉離體萌發和花粉管的生長，需要適當的硼酸和鈣離子。有研究認為，硼酸可以促進花粉對蔗糖的吸收和代謝，從而促進花粉萌發。適宜的外源硼酸濃度可促進花粉萌發和花粉管生長[10-11]。鈣離子的動態變化對花粉萌發啟動、花粉管的生長調節具有重要作用[12]，花粉是否正常萌發和花粉管是否正常伸長，直接影響植物的受精作用。外源鈣離子可促進花粉管伸長，即花粉管在花柱中快速生長，縮短授粉時間。Wang 等認為，外源鈣離子可以代替花粉萌發時的群體效應，因此，花粉離體萌發時，適宜濃度的鈣離子能促進花粉萌發[13]。本研究結果表明，適當濃度的硼酸和鈣離子對于茶樹的離體萌發和花粉管生長均具有明顯的促進作用。蔗糖在花粉離體培養時，常作為基本培養基，除了為花粉萌發提供營養，還可以調節花粉的滲透壓。本研究發現，適合茶樹最優的花粉離體培養的最優蔗糖濃度為150 g/L，與西南樺(Betulaalnoides)[14]、核桃[15-16]、曼地亞紅豆杉(Taxusmedia‘Hicksii’)[8]、肉果秤錘樹[17]所需的蔗糖濃度一致。說明150 g/L蔗糖濃度對于多數不同種類植物的花粉離體萌發比較適合。許林等研究表明，福鼎大白茶和臺茶12號花粉離體萌發的最適培養基為：10%(100 g/L)蔗糖+100 mg/L硼酸，花粉萌發率分別為54.09%和64.02%[7]；而本研究用培養基為100 g/L蔗糖+100 mg/L硼酸+100 mg/L硝酸鈣，其花粉萌發率為90.04%，這種差異可能是在培養基中添加了硝酸鈣，促進了花粉的萌發。

花粉活力的快速測定，是保證后續育種工作順利進行的前提。用染色法測定花粉活力，具有簡便、快速的優點，通常被用于快速檢測花粉活力[18]。TTC染色法原理是花粉萌發過程中由脫氫酶引起的氧化還原反應，將無色的TTC發生還原反應，生成紅色的三苯甲腙則有活力花粉被染成紅色，無活力花粉不顯色。5 g/L TTC可用于檢測曼地亞紅豆杉[8]和大豆[19]的花粉活力，而本研究結果以10 g/L TTC濃度的染色效果最好，這可能是因為不同物種花粉的差異導致。

有學者研究表明，福鼎大白茶的花粉萌發率可達到90%以上[2]。本研究的花粉活力測定方法結果與其相近，說明本試驗的花粉活力測定結果可靠。采用2種檢測方法的結果差異不顯著，則花粉離體萌發法和TTC法都可以用于檢測茶樹花粉活力，TTC法具有快速、易分辨、穩定性好等優點，且與花粉離體萌發結果相近，因此，10 g/L TTC可用于快速檢測茶樹花粉活力。

4 結 論

硼酸和硝酸鈣對于茶樹花粉離體萌發和花粉管的伸長和生長有顯著的促進作用，最適的茶樹離體萌發培養基是150 g/L蔗糖+150 mg/L硼酸+100 mg/L。本研究通過比較花粉離體萌發法與TTC染色法檢測茶樹花粉活力，結果表明，適合茶樹花粉活力測定的方法為花粉離體萌發法和TTC染色法，但TTC法具有快速、易分辨、穩定性好等優點，可用于茶樹花粉活力的快速測定，其最佳TTC濃度為10 g/L。