黑青稞根際促生菌篩選及其對種子萌發的影響

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(1.西藏農牧學院植物科學學院, 西藏 林芝 860000； 2.西藏農牧學院食品科學學院, 西藏 林芝 860000)

青稞起源于西藏，是藏族人民的主糧[1]。黑青稞含有多種有益人體健康的礦物質如銅、鋅、鐵等，同時具有高維生素、高膳食纖維、高蛋白質、高β-葡聚糖等特點，含有獨特的花青素類物質，且原花青素和總黃酮含量較高，具有防癌、抗癌作用的微量元素硒，符合現代人所青睞的黑色健康食品的需求，同時作為西藏重要的特色資源而倍受關注[2-4]。西藏有特殊的地理位置、氣候類型和地質歷史以及耕作習慣，從而造就了其獨特的土壤特征：N素少(全N 0.2～2 g/kg，速效N 20～80 mg/kg)，P 素缺(全P 0.22～1.42 g/kg，速效P 1～133 mg/kg)，K 素和微量元素比較豐富。這種土壤狀況制約了青稞的產量及質量的提高[5-6]。雖然化學肥料的使用可以在一定程度上解決這一問題，卻使得生產成本增加、環境惡化。

植物根際促進菌(plant growth promoting rhizobacteria ，PGPR)可視為有益微生物，其生物種類多元，如固氮菌可減少氮肥的使用，可將空氣中的氮以nitrogenase催化銨態氮源，減少對氮肥的依賴。磷肥在使用后會流失在土壤中，大部分的磷元素與土壤中的鈣、鎂、鋁、鐵結合后呈現不溶形態的復合物，而PGPR中有許多物種可產生有機酸或離子嵌合劑，將土壤中存在的磷酸鋁、磷酸胺鎂、磷酸鈣及磷酸鐵等磷酸復合體溶解，經由微生物轉化為有機磷，提供植物營養[7]。這些PGPR微生物常由健康植株中的土壤環境所篩選，并以其為原料研制而成的微生物肥料制劑在農業中也被廣泛應用。研究結果表明，施用微生物肥料不僅可以提高作用對象的產量和品質，而且還具有促進種子的萌發、提高發芽率和苗期成活率的作用[7-11]。

本試驗通過分離純化隆子縣黑青稞根際促生菌，篩選其中具有固氮、溶磷能力的菌株，發掘潛在的微生物資源，以減少青稞生產對化學肥料的依賴，為青稞可持續發展提供參考。

1 材 料

1.1 供試土壤及青稞

土壤樣品采自西藏山南隆子縣青稞田，取0～20 cm土層的根系( 帶土) 樣品，保存于無菌紙袋中帶回實驗室。供試青稞種子為西藏山南隆子縣黑青稞。

1.2 培養基及試劑

Ashby培養基： KH2PO40.2 g，CaCO35.0 g， MgSO4·7 H2O 0.2 g， Mannitol 10.0 g，NaCl 0.2 g，Agar 15 g，CaSO4·2 H2O 0.1 g，蒸餾水1 000 mL，pH=7.0～7.5[12]。

LB培養基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水1 000 mL，pH=7.0～ 7.2[12-13]。

無機磷培養基：葡萄糖10.0 g，(NH4)2SO40.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7 H2O 0.3 g，FeSO4·7 H2O 0.03 g，MnSO4·4 H2O 0.03 g，Ca3(PO4)25.0 g 蒸餾水1 000 mL，pH=7.0～ 7.2[14]。

蒙金娜培養基：葡萄糖10.0 g，(NH4)2SO40.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7 H2O 0.3 g，FeSO4·7 H2O 0.03 g，MnSO4·4 H2O 0.03 g，卵磷脂0.2 g，CaCO35.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH=7.0～ 7.5[14]。

以上培養基配制時均用蒸餾水定容至1 000 mL，121 ℃滅菌30 min，需要用固體培養基時，在此配方基礎上加20 g瓊脂。

2 方 法

2.1 黑青稞根際土壤懸液的制備

抖落黑青稞根系上較大的土壤顆粒，把根系剪切成3 cm左右的根段并混合，然后稱取10 g置于含有90 mL無菌水的三角瓶中，充分振蕩，即為黑青稞根際土壤懸液，將土壤懸液10 倍梯度稀釋，制成10-7～10-1土壤稀釋液[12]。

2.2 黑青稞根際促生菌初篩

分別取10-7～10-3土壤稀釋液1 mL于滅菌后的培養皿中，分別傾注Ashby培養基、無機磷培養基和蒙金娜有機磷培養基，置于28 ℃培養箱培養5～7 d，選取透明圈較大的單菌落進行復篩[12]。

2.3 黑青稞根際促生菌復篩

2.3.1 解磷能力

將初篩菌株接種于LB培養基中培養至對數期，按照1%的接種量分別接種到液體無機磷培養基、蒙金娜有機磷培養基中，于28 ℃、160 r/min振蕩培養7 d，4 ℃、18 000 r/min 離心5 min，采用鉬銻抗比色法測定有效磷含量[15]。

2.3.2 固氮量

將初篩菌株接種于LB培養基中培養至對數期，按照1%的接種量分別接種到液體Ashby培養基中，于28 ℃、160 r/min振蕩培養7 d，采用半微量凱氏定氮法測定含氮量[16]。

2.4 黑青稞根際促生菌菌株對黑青稞種子萌發的影響

將篩選的溶磷、固氮菌的菌株分別接種到蒙金娜液體培養基、無機磷液體培養基和Ashby液體培養基中，30 ℃、160 r/min振蕩培養至對數后期或穩定期，用無菌水稀釋至菌液濃度約為108cfu/mL，備用[17]。

表1 黑青稞PGPR固氮及有效磷含量測定結果

固氮菌氨氮(N,mg/L)解無機磷菌株有效磷含量(mg/L)解有機磷菌株有效磷含量(mg/L)HQ3-2124.31±0.72aSR9-456.37±1.49eSR6-183.87±2.22eHQ3-3116.02±1.33cSR10-651.88±1.37fSR6-2162.00±2.31bHQ3-5120.82±2.14bSR15-171.63±2.15dSR7-377.13±2.32fHQ6-3101.15±1.54fSQ15-275.75±0.76cSR10-675.75±0.76fHQ7-2105.3±1.59eLQ14-292.13±1.6bSR11-279.50±1.38efHQ7-4112.20±1.91dHQ9-151.38±0.52fSR11-380.00±0.8efN59104.30±0.60eHQ36-158.75±1.18eSR17-283.88±2.12eN63101.85±1.02fHQ36-2122.37±2.34aSR19-192.13±0.93dN72105.34±0.61eSR20-2251.38±2.43aSR22-375.75±2.27fLQ3-3129.00±2.41cLQ14-276.62±2.03f

注：同列不同小寫字母分別表示處理間在0.05水平有顯著差異。下同。

選取飽滿、均勻一致的黑青稞種子50粒，移至75%乙醇中處理30 s，無菌水清洗4～5次后，再用7%的 NaClO溶液浸泡1 min，無菌水清洗4～5次，進行種子表面消毒。將消毒的黑青稞種子分別浸入菌液中，25 ℃ 吸附1 h，于無菌操作臺上風干后，轉置于墊有潤濕濾紙的無菌培養皿內，25 ℃黑暗培養7 d。以浸泡無菌水的黑青稞種子做陰性對照，以不接菌的培養液做陽性對照。培養結束后，測量各幼苗莖長、根長，計數側根數[17]。

計算各項發芽指標：發芽勢(%)=(前3 d發芽種子數/種子總數)×100%；發芽率(%)=(7 d發芽種子數/種子總數)×100%；發芽指數(GI)=Gt/Dt。

式中：Gt為在t天內的發芽數，Dt為相應的發芽時間[17]。

2.5 數據處理

采用 Excel 2016軟件和SPSS 19.0軟件進行統計分析。

3 結果與分析

3.1 黑青稞根際促生菌的初篩及復篩結果

采用傾注培養基法，28 ℃培養，初步篩選出固氮細菌20株、解無機磷細菌28株、解有機磷細菌30株，經多次傳代，最終選取長勢較好、溶磷圈較大的固氮細菌9株、解無機磷細菌12株、解有機磷細菌8株進行復篩。

采用半微量凱氏定氮法定量測定9株固氮菌有效氮含量，結果如表1。由表1可知，菌株HQ 3-2、HQ 3-3、HQ 3-5和HQ 7-4固氮量較高，有效氮含量均達110 mg/L以上。采用鉬銻抗比色法定量測定無機磷細菌和有機磷細菌的有效磷含量(表1)，結果表明，溶解有機磷菌株SR 20-2、SR 6-2、LQ 3-3和SR 19-1產有效磷較高，均達到92 mg/L以上，其中菌株SR 20-2產磷最高，有效磷含量達251.38 mg/L。8株解無機磷細菌中有效磷含量最高的為菌株HQ 36-2，達122.37 mg/L，其次為菌株LQ 14-2，達92.13 mg/L，再次是菌株SR 15-2和SR 15-1，有效磷含量達71 mg/L以上；有效磷含量最差的是菌株SR 10-6、HQ 9-1和HQ 36-1。

3.2 黑青稞根際促生菌菌株對黑青稞種子萌發的影響

3.2.1 PGPR對黑青稞種子萌發的影響

分別選取優良固氮菌、無機磷溶解菌、有機磷溶解菌各4株進行黑青稞種子萌發實驗(表2)。由表2可知，除菌株HQ 3-2對青稞種子發芽具有抑制作用外，其余菌株對黑青稞種子發芽均有一定的促進作用。其中菌株HQ 3-3、HQ 7-4、SR 15-2、HQ 36-2和SR 6-2處理對黑青稞種子的萌發率效果較好，發芽率分別達到97.50%、92.50%、92.50%、91.67%和90.00%，與ck相比，發芽率分別增長了36.05%、29.07%、29.07%、27.91%和25.58%(表3)。

表2 黑青稞PGPR浸種對種子萌發的影響

菌株發芽率(%)發芽勢(%)發芽指數HQ3-222.5±2.50i14.17±2.89f3.75±0.65iHQ3-397.50±2.10a83.83±1.26a21.74±0.57aHQ3-585.00±2.80de71.50±1.32cd18.61±0.58cdHQ7-492.50±4.30b80.83±3.82a20.52±1.08bSR15-184.17±1.40de71.50±1.30cd18.44±0.36cdSQ15-292.50±2.30b80.17±2.25a20.52±0.63bLQ14-286.67±2.89cd73.17±1.61bc19.07±0.72cHQ36-291.67±1.44b78.50±1.23ab20.31±0.36bSR6-290.00±1.67bc71.67±1.41cd17.15±0.43efSR19-178.33±2.89fg73.33±2.21bc16.95±0.32efSR20-273.33±2.25h63.33±1.35e16.39±0.60fgLQ3-381.67±2.43ef66.67±1.89de17.85±0.12deck71.67±5.77h63.33±1.27e13.25±1.16hck172.50±2.50h62.50±1.50e15.98±0.50gck275.00±2.10gh71.67±1.44cd18.24±0.44cdck374.17±1.40gh64.17±1.80e16.68±0.54fg

注：ck為無菌水處理，ck 1為無機磷液體培養基處理，ck 2 為Ashby液體培養基處理，ck 3為蒙金娜液體培養基處理。下同。

由表2可知：菌株HQ 3-3、HQ 7-4、SR 15-2和HQ 36-2的發芽勢在75%以上，表3中菌株HQ 3-3、HQ 7-4、SR 15-2和HQ 36-2的發芽勢與ck相比，分別增長了32.37%、27.63%、26.58%和23.95%。同時菌株HQ 3-3、HQ 7-4、SR 15-2和HQ 36-2發芽指數在20以上，與ck對比提高了青稞種子的活力；不接菌的培養液對黑青稞種子萌發也有促進作用但效果不明顯。

圖1 HQ 3-5菌液處理與ck對比

表3 不同菌株菌液處理下發芽率、發芽勢及發芽指數變化量

菌株發芽率變化量(%)發芽勢變化量(%)發芽指數變化量HQ3-2-68.60-77.63-71.69HQ3-336.0532.3764.09HQ3-518.6012.8940.51HQ7-429.0727.6354.93SR15-117.4412.8939.20SQ15-229.0726.5854.93LQ14-220.9315.5343.94HQ36-227.9123.9553.35SR6-225.5813.1629.49SR19-19.3015.7927.91SR20-22.33023.70LQ3-313.955.2634.75

注：與ck對比的變化量。

3.2.2 PGPR對黑青稞幼苗的促生作用

表4 PGPR浸種對黑青稞幼苗生長的影響

菌株莖粗(mm)芽長(cm)根長(cm)須根數(個)HQ3-21.82±0.05cd7.37±0.19h3.27±0.09g5.6±0.15abHQ3-31.49±0.04h8.52±0.23f4.33±0.12d5.5±0.14bcHQ3-51.63±0.05f11.91±0.36c6.91±0.21a5.4±0.16cdHQ7-41.84±0.02c12.28±0.12b6.8±0.07a5.5±0.06bcSR15-11.56±0.04g4.10±0.11j1.77±0.05j5.6±0.15abSQ15-21.71±0.06e7.79±0.24g3.38±0.11g5.1±0.13fgLQ14-21.74±0.02e9.36±0.1e3.86±0.04e5.5±0.05bcHQ36-21.71±0.04e11.07±0.22d5.02±0.1b5.7±0.11aSR6-22.04±0.03a11.79±0.21c4.95±0.09b5.6±0.1abSR19-11.92±0.02b12.56±0.13b4.52±0.05c5.3±0.07deSR20-21.91±0.06b11.73±0.35c4.25±0.13d5.2±0.16efLQ3-31.77±0.03de13.67±0.24a3.88±0.07e4.7±0.08hck1.58±0.02fg9.66±0.1e3.65±0.04f5.3±0.09deck11.53±0.02gh7.85±0.21g3.81±0.1ef5.0±0.13gck21.39±0.04i5.18±0.13i2.05±0.06i3.9±0.11jck31.56±0.04g5.06±0.14i2.76±0.07h4.4±0.12i

由表4可知，除菌株HQ 3-2、HQ 3-3、SR 15-1、SR 15-2和LQ 14-2外，其他菌株與ck對比差異顯著(p<0.05)，對青稞幼苗芽生長有促進作用。其中LQ 3-3菌液處理的芽長最長，為13.67 cm。菌株HQ 3-5、HQ 7-4、HQ 36-2、SR 6-2、SR 19-1、SR 20-2和LQ 3-3與ck對比(如表5)，芽長增加分別為23.29%、27.12%、14.60%、22.05%、30.02%、21.43%和41.55%。菌株HQ 3-5和HQ 7-4培養液處理的種子根長到達6.8 cm，分別比ck根長增加89.31%、86.30%(如圖1，圖2)。菌株SR 15-1菌液的處理對芽生長有抑制作用，同時對幼苗的地下部分有明顯的抑制作用，與ck對比(如表5)芽長及根長分別下降 57.56%和 51.60%。

由表5可知，各菌株菌液處理中對黑青稞幼苗的須根數有一定的促進作用但是效果不明顯。SR 6-2、SR 19-1和SR 20-2菌液處理中莖粗比ck增加20%以上，其中SR 6-2菌液處理莖粗達到2.04 mm；不接菌的培養液處理對青稞幼苗的芽長、根長、莖粗及須根數有抑制作用。

表5 不同菌株菌液處理下莖粗、芽長、根長及須根數變化量

菌株莖粗變化量(%)芽長變化量(%)根長變化量(%)須根數變化量(%)HQ3-214.98-23.71-10.415.66HQ3-3-5.91-11.8018.633.84HQ3-52.9623.2989.321.89HQ7-416.4627.1286.303.84SR15-1-1.27-57.56-51.605.66SQ15-28.44-19.32-7.49-3.77LQ14-210.13-3.075.753.84HQ36-28.2314.6037.537.55SR6-229.1122.0535.625.72SR19-121.5230.0223.840SR20-221.0921.4316.44-1.89LQ3-312.0341.556.30-11.26

注：與ck對比的變化量。

4 結論與討論

1) 試驗結果表明：通過初篩和復篩，篩選出了活性較高的固氮菌、溶解無機磷細菌和溶解有機磷細菌各4株，固氮菌分別為菌株HQ 3-2、HQ 3-3、HQ 3-5和HQ 7-4，無機磷溶解細菌分別為菌株SR 20-2、SR 6-2、LQ 3-3和SR 19-1，有機磷細菌分別為菌株HQ 36-2、LQ 14-2、SR 15-2和SR 15-1。分別用以上菌株100倍菌液對黑青稞種子進行浸種處理，結果表明：不同菌株對青稞種子及幼苗的促生作用不同。菌株HQ 3-3、HQ 7-4和SR 15-2對黑青稞種子發芽促進作用顯著，與對照相比發芽率分別增長了36.05%、29.07%和29.07%；菌株SR 19-1和LQ 3-3對青稞種子芽生長有顯著的促進作用，分別較對照增加了30.02%和41.55%。菌株HQ 3-5和HQ 7-4對青稞幼苗地下部分生長有顯著的促進作用，分別較對照顯著增加了89.31%和86.30%。本試驗也篩選出了同時對青稞種子萌發及幼苗生長都有促進作用的菌株固氮菌HQ 7-4、解有機磷菌株HQ 36-2、解無機磷菌株SR 6-2和SR 19-1，為青稞微生物菌肥的研制提供了功能菌株。

圖2 HQ 7-4菌液處理與ck對比

2) 近年來，探尋新肥源 (微生物菌肥)以替代或部分替代化肥的研究越來越受到重視，而PGPR的促進植物生長，改良土壤其對礦質營養的吸收和利用，并能抑制有害生物的有益菌類等功能，是微生物菌肥良好的原料之一[18-21]。PGPR菌肥研究取得研究成果較多，邱勤等[22]使用PGPR菌劑對新墾地土壤接種，顯著提高了土壤的各項基本化學肥力指標。韓光等用復合型PGPR對土壤培肥效果研究表明，PGPR處理后，土壤有機質、全氮、全磷、全鉀、有效磷和速效鉀的分別提高了42.2%、58.8%、8%、12.6%、37.2%和 40.2%[23]。逄煥成等[24]用解鉀細菌和芽孢桿菌的菌劑處理土壤，土壤中的有機質、全氮、有效磷和速效鉀分別提高了55.9%、50.2%、71.4%和 28.9%。本研究篩選的功能細菌，有望研制出提高西藏土壤肥力的PGPR菌肥。

3) 作物種子的萌發受到許多外在和內在因素的影響，萌發狀態影響著成苗率和幼苗質量，而成苗率和幼苗質量是播種質量的重要因素，也是提高田間植株質量的關鍵因素[25]。本研究用固氮、溶磷菌液處理黑青稞種子，通過發芽率、發芽勢和發芽指數來說明種子活力的高低；以幼苗的莖粗、芽長、根長、須根數來說明菌液對幼苗的作用。

由于本試驗所篩細菌具有多種促生能力，將這些細菌進行組合后，有望在西藏較為貧瘠的土壤上收到明顯效果并得到應用。當然，需要進行菌株組合及溫室盆栽試驗，進一步研究證實。