西雙版納12種食用香料植物精油 抑制炎癥因子NO活性研究

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(1.中國科學院西雙版納熱帶植物園熱帶植物資源重點實驗室,云南勐臘 666303; 2.中國科學院大學,北京 100049)

食用香料植物又叫作香辛料,大多具有芳香、辛辣等刺激性氣味,具有殺菌、抗氧化、抗炎等藥理作用,用于食物調味調香。從香料植物中提取的物質不僅能改善食物的風味，還可作為天然防腐劑延長食物的保質期[1]。

精油作為香料植物中的主要成分,存在于植物的根、莖、葉、花、果實、種子等部位,是植物次生代謝產物,易于揮發并具有愉悅的氣味,西方中世紀就已廣泛應用[2]。現代藥理學研究表明，精油在抗菌[3-4]、抗氧化[5]、抗炎[6]、抗癌[7]等方面具有重要的作用。Giselle等[8]研究表明,馬鞭草精油對組胺等引起的小鼠后肢腫脹具有很好的消腫效果;Sharif等[9]研究表明酸棗果實精油對TPA(佛波酯)誘導的小鼠皮膚炎癥有較好的治療效果;Lin等[10]研究表明臺灣肉桂果實精油對細菌脂多糖(LPS)誘導的炎癥因子NO、TNF-alpha等的產生具有顯著的抑制作用。一氧化氮(NO)作為炎癥反應的標志產物之一,正常情況下,體內的NO含量較低[11]。當機體受到外界(物理、化學、生物等)刺激時,iNOS被激活,進而大量合成NO并參與多種疾病的病理反應，如高血壓、風濕性關節炎、動脈粥樣硬化等[12]。因此,藥理學上將是否可以抑制NO合成,作為判斷某種物質是否具有抗炎活性的重要指標。目前,臨床上抗炎藥有兩大類:甾體類和非甾體類。由于抗炎藥的過度使用,耐藥性、毒副作用及新的相關病癥增加,迫切需要尋找新的低毒、高效的新型抗炎藥[13]。

西雙版納地處我國云南南部,芳香類植物十分豐富,這里是傣族為主的少數民族聚居地,當地各民族傳統用各種香料植物防治蚊蟲叮咬、清熱解毒、消腫止痛。據文獻及對當地藥用植物調查選取以下12種具有藥食兩用的芳香植物作為研究對象,其性狀如下:跳蚤草(AdenosmabuchneroidesBonati.):草本,生長于海拔580～900 m,具特殊香氣[14];錫蘭肉桂(CinnamomumverumPresl.):常綠喬木,枝干灰色具白斑,葉革質或近革質對生[15];水香薷(ElsholtziakachinensisPrain.):草本,莖具絨毛,葉卵形或卵狀披針形,基部以上具圓齒,兩面疏被絨毛[16];野拔子(E.rugulosaHemsl.):草本至半灌木,莖多分枝,密被白色絨毛,葉卵形,橢圓址菱狀卵形[17];草八角(Limnophilarugose(Roth)Merr.):多年生宿根草本,葉卵形邊緣具齒,莖葉具八角香氣[14];山蒼子[Litseacubeba(Lour.)Pers.]:灌木或小喬木,葉互生,披針形或長圓形,具芳香氣味[18];蒜香藤[Mansoaalliacea(Lam.)A.H.Gentry.]:常綠藤狀灌木,具卷須,二出復葉,深綠橢圓形,有大蒜氣味[19];小蕓木[Micromelumintegerrimum(Buch-Ham.)Roem.]:小喬木,樹皮灰色,葉軸、花序均綠色,密被絨毛,成熟果實黃色,具香氣[14];毛葉丁香羅勒(OcimumgratissimumLinn. var.suave(Willd.)Hook.f.):丁香羅勒于薄荷羅勒雜交種,多年生灌木,葉、莖具芳香氣味[20];馬來樹胡椒(PiperarborescensRoxb.):小喬木,樹皮灰色,葉軸、花序均綠色,密被絨毛,成熟果實黃色,具香氣[14];巴西樹胡椒(P.hispidinervumC. DC.):常綠叢生灌木,呈小喬木狀,枝葉、果芳香[14];清香木(PistaciaweinmannifoliaJ. Poisson ex Franch.):灌木或小喬木,小葉葉柄被絨毛,革質,長圓形或倒卵狀長圓形[14]。因此推測這些芳香植物具有抗炎的效果,對炎癥相關因子NO具有較好的抑制作用。此前已有很多文獻報道這里芳香植物的成分[14],但對其抗炎功效的研究報道較少。

本研究選用對炎癥反應較為敏感的RAW264.7細胞,測定12種香料植物精油的抗炎活性,并通過GC-MS聯用技術,對具有顯著抑制作用的植物精油的化學成分進行測定,為這些植物精油提供抗炎作用的理論依據，并為其可能發揮治療炎癥并發癥(糖尿病、動脈粥樣硬化等)的作用提供一定的指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

食用香料植物 具體信息見表1,均采自中科院西雙版納熱帶植物園;小鼠單核巨噬細胞白血病細胞株RAW264.7 中國科學院昆明動物研究所動物種質資源庫。青/鏈霉素、DMEM高糖培養基 Hyclone公司;胎牛血清、谷氨酰胺 Gibco公司;磷酸鹽緩沖液、LPS、地塞米松(Dex)、二甲基亞砜(DMSO) Sigma公司;NO檢測試劑盒、MTS([3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲酯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑,內鹽]試劑盒 Promega公司。

表1 實驗材料Table 1 Experiment materials

REF5250040多功能酶標儀 美國Thermo scientific;Agilent 7890/5975C GC-MS氣相色譜-質譜聯用儀 美國Agilent Technologies;98-1-B電熱套 天津市泰思特儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 植物精油的提取 精油提取:采集新鮮所需材料,去除腐爛及發霉材料,自然陰干,粉碎。稱取一定質量的材料加入去離子水,采用水蒸氣蒸餾法,沸騰的同時在精油接受口用500 mL錐形瓶(其中加入20～30 mL乙醚)提取精油。乙醚及精油被收集在一起,之后通過旋轉蒸發去除乙醚。置于冰箱(4±2) ℃保存[23]。

1.2.2 細胞活力評估 用含10%胎牛血清,1000 U/L青、鏈霉素、2 mmol/L谷氨酰胺的DMEM培養基置于37 ℃ 含5% CO2的生物安全柜中培養RAW264.7細胞。取對數生長期RAW264.7細胞制成濃度為1×106個/mL的細胞懸液,種于96孔板中。每孔100 μL,每組3個平行,貼壁培養18 h。吸去原有培養基,PBS洗兩次,空白組更換為新鮮培養基,LPS組加入含濃度為1 μg/mL LPS各100 μL,其他組加入含不同濃度精油(0.001%、0.002%、0.004%、0.005%)的培養基,繼續培養24 h。按照每孔20 μL的比例加入MTS,于490 nm處測定吸光度值[24]。

1.2.3 NO含量測定 將處于對數生長期的RAW264.7細胞按照1×106個/mL接種于96孔板中,每孔100 μL。設置空白對照組(C組)、Dex組(100 μL/孔培養基中含濃度為1 μg/mL LPS及10 μmol/L Dex)、LPS組(1 μg/mL LPS 100 μL/孔),不同精油+LPS組(不同種濃度精油+LPS濃度為1 μg/mL),每組3個平行。貼壁18 h后,用不同濃度精油(0.001%、0.002%、0.004%、0.005%)預處理30 min,Dex預處理濃度為10 μmol/L。之后除空白組外其余各組均用含1 μg/mL LPS培養基孵育24 h。10000 r/min,5 min后,收集上清,按照Griess試劑盒操作說明,對上清中NO含量進行檢測[25]。

1.2.4 具有明顯抑制作用精油成分測定 成分測定:采用氣相色譜-質譜聯用儀進行成分分析,方法如下:吸取一定體積精油加入合適的溶劑(CH2CL2或正己烷)進行溶解,置于自動進樣器,設置相應的參數,運行。

氣相條件:色譜柱:Agilent 19091J-115,HP-5(5% Phenyl Methyl Siloxan,50 m×0.32 mm×0.52 um);進樣口溫度:250 ℃;柱箱升溫程序:50 ℃起始,以5 ℃/min的速率從100 ℃,保持5 min,然后以25 ℃/min的速率從100 ℃升到250 ℃保持5 min;進樣量:1 μL分流比50∶1;進樣口壓力:90 kPa;流速:1.8 mL/min。

質譜條件:電離方式EI,電子轟擊能量70 eV,掃描范圍m/z 50～550;離子源溫度230 ℃;四級桿溫度150 ℃。

化學成分鑒定:采用NIST14數據庫對質譜圖進行自動檢測,參考相關文獻中質譜資料(線性保留指數由一系列直鏈烷烴在HP-5(C8～C30)毛細管色譜柱的保留時間計算決定)[25],最終對精油的化學成分進行定性分析(RI計算公式為IX=RI1+[RI2-RI1]/[RT2-RT1]×[RT2-RTX],其中IX為計算化合物的保留指數,RI1,RTX,RT2分別為前面化合物,待計算化合物及后面化合物的保留時間,RI1,RI2分別為前面化合物和后面化合物的保留指數)。色譜峰面積運用歸一化定量,計算得出各組分百分含量。

1.3 數據處理

實驗數據采用Graph Prism 5.0進行分析,組間比較用單因素方差分析(One-Way ANOVA),組間兩兩比較采用Dunnett’s t-test檢驗,計量資料用均數±標準差(Mean±SD)表示,p<0.05有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 12種植物精油對RAW264.7細胞活性的影響

圖1～3均與C組比較,圖4～6均與LPS組比較。*表示差異顯著(p<0.05)**表示差異極顯著(p<0.01)***表示差異高度顯著(p<0.001),圖2～圖6同。圖1～圖3表示精油濃度在一定范圍內,各種來源的植物精油對RAW264.7細胞活力的影響。馬來樹胡椒精油在濃度為0.005%對細胞有顯著抑制作用(p<0.05),細胞活力降至81.62%，蒜香藤精油在濃度為0.004%及0.005%是對細胞有高度顯著抑制作用(p<0.001),細胞活力降至64.18%、54.32%,因此，未進行后續NO含量的測定。精油作為一種混合物,可能是其中的多種成分共同起作用,表現出對RAW264.7細胞一定的抑制作用;巴西樹胡椒精油、跳蚤草精油、小蕓木精油、山蒼子葉精油濃度在0.001%～0.005%范圍內對細胞活力有一定的促進作用，但差異不顯著(p>0.05),水香薷精油、錫蘭肉桂精油、野拔子精油、清香木精油、草八角精油、毛葉丁香羅勒精油濃度在0.001%～0.005%范圍內對細胞活力無顯著影響(p>0.05)。與Li等[25]、董麗華等[26]報道的麻欠、花椒精油對細胞活力的影響結果類似。

圖1 植物精油對RAW264.7細胞活力的影響Fig.1 Effects of plants essential oil on cell viability in RAW264.7 cells

圖3 植物精油對RAW264.7細胞活力的影響Fig.3 Effects of plants essential oil on cell viability in RAW264.7 cells

2.2 各種精油對LPS誘導的NO產生的影響

圖4～圖6,表明在0.001%～0.005%濃度范圍內,在LPS刺激24 h后,空白組細胞NO產生量分別為:(2.33±0.13)、(0.89±0.08)、(1.31±0.03) μmol/L,LPS組NO生成量顯著升高為:(40.69±0.79)、(46.44±1.78)、(40.53±0.96) μmol/L,與楊晶晶[25]等的造模結果類似,表明造模成功;而馬來樹胡椒精油、錫蘭肉桂精油、水香薷精油在濃度為0.001%～0.005%濃度范圍內對NO產生具有高度顯著抑制作用(p<0.0001),清香木精油在0.002%～0.005%濃度范圍內對NO產生具有高度顯著抑制作用(p<0.0001)、毛葉丁香羅勒精油(0.005%)、蒜香藤精油(0.002%)對NO的產生具有高度顯著的抑制作用(p<0.0001),并呈濃度依賴型,上述精油中，除毛葉丁香羅勒及蒜香藤外,其他精油在(0.001%～0.005%)濃度范圍內抑制效果均優于陽性對照地塞米松(Dex)。抑制強度順序為馬來樹胡椒>水香薷>錫蘭肉桂>清香木>蒜香藤>毛葉丁香羅勒。

圖4 植物精油對LPS誘導RAW264.7細胞產生NO的影響Fig.4 Effects of plants essential oil on NO production in RAW264.7 cells induced by LPS

圖5 植物精油對LPS誘導RAW264.7細胞產生NO的影響Fig.5 Effects of plants essential oil on NO production in RAW264.7 cells induced by LPS

圖6 植物精油對LPS誘導RAW264.7細胞產生NO的影響Fig.6 Effects of plants essential oil on NO production in RAW264.7 cells induced by LPS

2.3 具有顯著抑制作用精油的成分分析

對具有顯著抑制效果的馬來樹胡椒、錫蘭肉桂、清香木、毛葉丁香羅勒、蒜香藤和水香薷的精油成分進行了分析,結果見表2～表7。

表7 水香薷精油主要化學成分(含量大于1%)Table 7 Chemical compositions of E. kachinensis Essential oil

表2 馬來樹胡椒精油主要化學成分(含量大于1%)Table 2 Chemical compositions of P. arborescens essential oil

圖7 馬來樹胡椒精油氣相色譜圖Fig.7 The GC-MSFigure of P. arborescens essential oil

馬來樹胡椒精油化學成分共鑒定出74種化合物。含量在1%以上的有9種,如表2所示,含量最高的為洋元荽醚(57.28%),其他含量較高的依次為百里酚:7.43%,雙環[7.2.0]碳-4-烯:3.09%,p-傘花烯:2.87%。

圖8 錫蘭肉桂精油氣相色譜圖Fig.8 The GC-MSFigure of C. verum essential oil

錫蘭肉桂精油化學成分共鑒定出26種化合物。含量在1%以上的有6種,如表3所示,含量最高的為5-烯丙基愈創木烯為84.03%,其他依次為反式肉桂醛4.63%,1-石竹烯3.45%。

表3 錫蘭肉桂精油主要化學成分(含量大于1%)Table 3 Chemical compositions of C. verum essential oil

圖9 清香木精油氣相色譜圖Fig.9 The GC-MSFigure of P. weinmannifolia essential oil

清香木精油化學成分共鑒定出化合物58種。含量在1%以上的有14種,如表4所示,含量最高的為α-蒎烯:43.39%,其次依次為D-檸檬烯:9.12%,β-蒎烯:7.76%,莰烯:6.61%等。

表4 清香木精油主要化學成分(含量大于1%)Table 4 Chemical compositions of P. weinmannifolia essential oil

圖10 毛葉丁香羅勒氣相色譜圖Fig.10 The GC-MSFigure of O. gratissimum essential oil

毛葉丁香羅勒精油化學成分共鑒定出化合物40種。含量在1%以上的有6種,如表5所示,含量最高的為丁香酚苯乙醚:67.29%,其他依次為1,3,6-羅勒烯:13.62%,4-異丙基-3-甲基苯酚:3.69%等。

表5 毛葉丁香羅勒精油主要化學成分(含量大于1%)Table 5 Chemical compositions of O. gratissimum essential oil

圖11 蒜香藤精油氣相色譜圖Fig.11 The GC-MSFigure of M. alliacea essential oil

蒜香藤精油化學成分共鑒定出22種化合物。含量在1%以上的有6種，如表6所示,含量最高的為二烯丙基二硫醚:56.54%,其他依次為二烯丙基三硫醚:24.06%,二烯丙基硫醚:4.77%,1-辛烯-3-醇:4.74%,二烯丙基四硫醚:4.09%等。

表6 蒜香藤精油主要化學成分(含量大于1%)Table6 Chemical compositions of M. alliacea essential oil

圖12 水香薷精油氣相色譜圖Fig.12 The GC-MSFigure of E. kachinensis Essential oil

水香薷精油化學成分共鑒定出31種化合物。含量在1%以上的有6種，如表7所示,含量最高的為D(+)-Carvone(右旋香芹酮):46.53%,其他依次為1-(3-甲基-2-呋喃基)-3-甲基-2-丁烯-1-酮:33.13%,1-Octen-3-ylacetate(1-辛烯-3-醇乙酸酯):4.64%等。

通過GC-MS對其成分進行分析可知,抗炎活性成分可能與精油中的D-檸檬烯、α-蒎烯[27-31]、肉桂醛[32]等物質相關。蒜香藤中二烯丙基二硫醚、二烯丙基三硫醚等和大蒜中的成分類似,這些可能是蒜香藤中的抗炎活性物質[33]。

3 結論

本實驗選取西雙版納地區12種食用香料植物精油作為研究對象,首次報道跳蚤草、水香薷、野拔子、草八角、蒜香藤、小蕓木、毛葉丁香羅勒、馬來樹胡椒、巴西樹胡椒等精油的抗炎活性。其中馬來樹胡椒精油、錫蘭肉桂精油、清香木精油、毛葉丁香羅勒精油、蒜香藤精油和水香薷精油對炎癥因子NO的產生具有顯著的抑制效果。其抑制NO活性大小依次為馬來樹胡椒>水香薷>錫蘭肉桂>清香木>蒜香藤>毛葉丁香羅勒。上述精油中,低濃度的馬來樹胡椒精油表現出更好的抗炎效果且對細胞活力無顯著影響。通過GC-MS對馬來樹胡椒精油、巴西樹胡椒精油、毛葉丁香羅勒精油等成分進行分析,精油成分以烯烴類為主,其主要成分多樣,抗炎作用可能是多成分共同作用。本研究為傣族人民對這些植物的傳統藥用及食用提供了科學的依據。此外,馬來樹胡椒精油、錫蘭肉桂精油、清香木精油、毛葉丁香羅勒精油等作為一種天然抗炎材料在藥用及功能食品產業等方面具有較大的潛力。這些植物精油抗炎活性機制有待進一步研究。