高效液相色譜法測定酵母抽提物中谷氨酸的研究

李素媛 喻璽 劉恒 余佳 余術 黃龍 趙吉媛

摘 要：采用高效液相色譜柱前衍生法測定酵母抽提物中谷氨酸的含量，以苯異硫氰酸作為柱前衍生試劑，在C18柱上，弱堿性條件以保留時間定性、外標法定量。結果表明，在0.2～1.0mg/mL線性范圍內，線性相關系數為0.999816，相對標準偏差小于5%，回收率在95%～110%，樣品檢測結果良好。該方法還可以用于其他氨基酸的檢測。

關鍵詞：高效液相色譜法；谷氨酸；柱前衍生

中圖分類號 O657.72 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2018）18-0018-02

Determination of Glutamic Acid in Yeast Extract by HPLC

Li Suyuan et al.

（Three Gorges Product Quality Inspection and Testing Center，Yichang 443000，China）

Abstract：The content of glutamic acid in yeast extract was determined by high performance liquid chromatography column derivatization. Benzo thiocyanic acid was used as a pre column derivatization reagent. On the C18 column，the retention time was qualitative and the external standard was quantified under the condition of weak alkali. The results show that in the linear range of 0.2～1.0mg/mL，the linear correlation coefficient is 0.999816，the relative standard deviation is less than 5%，the recovery rate is between 95%～110%，and the sample test results are good. This method can also be used for the detection of other amino acids.

Key words：High performance liquid chromatography（HPLC）；Glutamic acid；Pre column derivatization

氨基酸是構成蛋白質的基本單元，是動物體合成蛋白質的主要原料，是食品、飼料的營養(yǎng)成分，也是生物工程、生化制藥、表面活性劑工業(yè)產品的化工原料，因此它們的分離分析引起了人們的關注[1-4]。目前，安全國家標準《食品中氨基酸的測定》規(guī)定用氨基酸分析儀測定食品中氨基酸含量，但氨基酸分析儀價格昂貴，操作繁鎖，分析時間長，儀器專一性強、成本高，所用試劑及材料價格不菲，且只能用于分析氨基酸，使氨基酸的快速、簡便分析受到了限制[5-6]。近幾年，高效液相色譜測氨基酸已成為研究熱點[7-8]，由于大多數氨基酸無法被天然的紫外或熒光吸收，需要進行柱前、柱后[9-10]衍生化才能達到檢測目的。本文以苯異硫氰酸作為柱前衍生試劑，在弱堿性條件下，氨基酸的α-氨基酸可與苯異硫氰酸反應生成相應的苯氨基甲酰氨基酸。經分離后，可在反相高效液相色譜（RP-HPLC）分析，并通過紫外檢測器定性、定量。液相色譜通用性強，檢測靈敏度高，可用于多種物質的分析。

1 材料與方法

1.1 器材與試劑 冰乙酸（優(yōu)級純），乙腈（色譜純），無水乙酸鈉（優(yōu)級純），去離子高純水，色譜柱（C18，5μm，4.6mm×250mm，Waters），高效液相色譜儀（Waters e2695）。

1.2 實驗條件

1.2.1 色譜條件 流動相為A相乙腈，B相稱取無水固體乙酸鈉8.2g加水至1000mL，用乙酸調節(jié)pH值=6.5，過濾膜，超聲脫氣，檢測波長254nm，進樣量為10μL，流速為1.0mL/min，柱溫25℃。

1.2.2 梯度洗脫

1.2.3 衍生劑 衍生劑A，取異硫氰酸苯酯1.2mL用乙腈定容到100mL；衍生劑B，取三乙胺13.9mL用乙腈定容到100mL。

1.2.4 標準溶液的配制 稱取谷氨酸標品0.5g（精確至0.01mg）于50mL容量瓶中，用乙腈溶解定容，此母液濃度為10mg/mL。用此母液逐級稀釋，配制標準系列0.2mg/mL，0.4mg/mL，0.6mg/mL，0.8mg/mL，1mg/mL。

1.2.5 樣品前處理 準確稱取適量試樣，一般固體1～5g左右，液態(tài)試樣20g左右，置于100mL錐形瓶中，加入40℃～50℃溫水至30mL，如果試樣中含淀粉，加入淀粉酶0.2g，振搖混勻，蓋上瓶塞，在55℃±5℃水浴條件下，酶解120min，如果試樣不含淀粉，直接超聲提取20min。冷至室溫，用0.1mol/L鹽酸調節(jié)pH值5.0±0.1，加入5mL0.5mol/L硫酸鋅溶液，充分混合，轉入50mL容量瓶中，用水定容至刻度并充分混勻后，離心。取上清液1mL于離心管中，分別加入衍生劑A和B1mL，室溫靜置1h，在衍生好的樣品中加入正己烷2mL，震蕩后靜置10min，取下層清液用水稀釋5倍后，過0.45μm濾膜，上液相色譜儀。標樣采用同樣的方法衍生處理。

2 結果與分析

2.1 線性關系及檢出限 按照條件將谷氨酸的標準系列濃度進樣，確定保留時間為5min，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標繪制工作曲線。在0.2～1mg/mL線性范圍內，谷氨酸的線性回歸方程為y=9.49e+005x+1.82e+006，線性相關系數r2為0.999816。

2.2 精密度實驗 平行稱取安琪酵母抽提物樣品5份，直接超聲提取20min。冷至室溫，用0.1mol/L鹽酸調節(jié)pH值5.0±0.1，加入5mL0.5mol/L硫酸鋅溶液，充分混合，轉入50mL容量瓶中，用水定容至刻度并充分混勻后，離心。離心液與標準谷氨酸溶液同樣方法衍生后進行分析。結果如表2。

結果表明，平行樣間谷氨酸的相對標準偏差RSD小于5%，重現性較好。

2.3 回收率 稱取同樣的酵母抽提物樣品5份，稱樣量1g左右，經檢測樣品中谷氨酸含量為2.276%，分別加入10mg/mL的谷氨酸標準溶液2mL，經同樣處理后進儀器檢測，谷氨酸的加標回收率結果如表3。

2.4 其它氨基酸檢測 采用同樣的衍生處理方法和儀器檢測條件，對絲氨酸、甘氨酸、精氨酸等18種氨基酸進行檢測，各組分分離完全，線性好，所以該方法也可以用于混合氨基酸檢測。

3 結論

以苯異硫氰酸作為柱前衍生的衍生試劑，在弱堿性條件下，經分離后，衍生產物在高效液相色譜上分離，紫外檢測器測定谷氨酸的含量。該方法通用性強，樣品前處理步驟簡單，檢測靈敏度高，重現性好，加標回收率高，結果準確可靠，可用于多種物質的分析。

參考文獻

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（責編：王慧晴）