準噶爾山楂殘渣多糖對D-半乳糖衰老模型小鼠的影響

馬 雪，呂海英,2,*，李 進,2，張 玉，張 俊

（1.新疆特殊環境物種保護與調控生物學實驗室，新疆 烏魯木齊 830054；2.新疆師范大學生命科學學院，新疆 烏魯木齊 830054；3.干旱區植物逆境生物學重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830054）

準噶爾山楂（Crataegus songorica K. Koch.）是薔薇科（Rosaceae）山楂屬（Crataegus）落葉灌木或小喬木植物，作為新疆特有植物，僅分布于伊犁地區[1]。其果實富含花色苷[2]、熊果酸[3]、黃酮類物質[4]等，極富營養價值，在食品、醫藥等方面日益受到重視。然而，準噶爾山楂果實在提取花色苷后的殘渣被當成廢棄物丟棄，而其中仍含有大量的多糖類物質[5]，這不僅浪費了大量的資源，而且污染了環境。研究發現多糖廣泛存在于微生物細胞壁和動植物體內[6]，參與機體各種生理代謝，具有抗氧化、抗衰老、抗癌、抗腫瘤、降血糖、降血脂、免疫調節[7-15]等多種生物活性，得到廣泛的應用和發展。

目前關于山楂多糖的研究主要集中在提取、純化及結構鑒定[16-22]方面，對于提取過花色苷的山楂殘渣中的多糖成分是否仍具有生物活性鮮見報道。因此，為達到高效利用新疆特有植物準噶爾山楂資源的目的，本實驗以準噶爾山楂殘渣為原料，通過超聲波輔助水提醇沉法[23]提取多糖，研究其對D-半乳糖致衰老小鼠的影響，以期為準噶爾山楂這一特色資源的綜合利用和開發提供理論依據，從而使我國西北野生植物盡快向生產轉化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

準噶爾山楂成熟果實，2015年9月采于新疆伊犁果子溝。取已提取過花色苷的準噶爾山楂殘渣，60 ℃烘干后磨粉，過篩，備用。

（20±2）g左右的清潔級昆明雄性小鼠90 只，由新疆維吾爾自治區實驗動物中心提供，合格證號：SCXK（新）2011-0001。

總抗氧化能力（total antioxidative capability，T-AOC）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）檢測試劑盒 南京建成生物工程有限公司；D-半乳糖 美國Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

UV-2800型紫外-可見分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司；SHZ-III循環水多用真空泵 上海市滬西儀器廠；FA1104N電子天平、HHS-數顯恒溫水浴鍋 上海精密科學儀器有限公司；JYD001-2007石蠟切片機 浙江金華益迪醫療設備廠；ZK-82A型真空干燥箱 上海實驗儀器總廠；RE-52型旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；TDL-60-B臺式離心機 長沙湘儀儀器有限公司；KQ-250DE型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 準噶爾山楂粗多糖的制備

5 g山楂粉末→90 ℃蒸餾水浸提60 min→減壓濃縮→雙氧水氧化脫色→Sevag試劑除蛋白→4 000 r/min離心10 min→上清液加5 倍體積的體積分數95%乙醇溶液→4 ℃靜置24 h→減壓抽濾分離絮狀沉淀→乙醇、丙酮溶液淋洗3 次→60 ℃恒溫箱烘干→得粗多糖。

1.3.2 樣品溶液的制備

取準噶爾山楂粗多糖，配制質量濃度為200、400、800 mg/mL[24]的多糖類化合物藥液，于-20 ℃保存備用。

1.3.3 動物分組及給藥

小鼠飼養溫度（24±2）℃，相對濕度45%～65%，適應性喂養一周，根據體質量將小鼠隨機分為6 組，每組15 只：正常對照組、D-半乳糖衰老模型組、多糖低劑量組、多糖中劑量組、多糖高劑量組、VE對照組。正常對照組每日上午10：00頸背部皮下注射1 mg/g mb生理鹽水，其余組注射1 mg/g mbD-半乳糖藥液，正常對照組、模型組給予等體積生理鹽水，VE對照組灌胃50 mg/mL VE藥液，多糖低、中、高劑量組分別灌胃200、400、800 mg/mL多糖類化合物藥液，普通飼料常規喂養建立D-半乳糖衰老模型。小鼠每周測量2 次體質量，根據體質量變化適當增減給藥劑量[25]。

1.3.4 測試樣品的準備

給藥8 周后，小鼠禁食不禁水12 h，稱量小鼠體質量。摘除小鼠眼球，取得眼眶血，2 000 r/min離心10 min，取上層清液，-20 ℃保存備用[26]。小鼠脫臼處死后，迅速取出肝、腦組織，按1∶9（m/V）加入質量分數0.86%的生理鹽水，冰水浴下研磨，使組織勻漿化，3 000 r/min離心10～15 min，取上清液-20 ℃保存備用[27]。

1.3.5 相關指標的檢測

1.3.5.1 臟器指數

小鼠處死后，剖離胸腺和脾臟，稱取質量，并按下式分別計算胸腺和脾臟指數。

1.3.5.2 抗氧化指標測定

取小鼠血清及肝、腦組織勻漿上清液，按照試劑盒說明書所示測定MDA含量、T-AOC及GSH-Px活力。

1.3.5.3 肝、腦組織切片的制作及病理形態學觀察

小鼠解剖后迅速摘取肝、腦組織切塊為1.0 cm×1.0 cm×0.2 cm的薄片→放入中性福爾馬林固定液中固定24 h→分別經75%（體積分數，下同）、85%、95%、100%乙醇溶液脫水1 h→100%乙醇脫水30 min→放入二甲苯透明處理15 min→石蠟包埋組織塊→切片→烤片1 d→蘇木精染色液中染色10～30 min→流水沖洗約15 min→沖洗后將切片放入體積分數1%鹽酸-乙醇溶液中褪色→流水中使其恢復藍色→將切片按次序分別放入50%、70%、80%乙醇中各3～5 min→體積分數0.5%伊紅復染1 min→取出后將切片放入95%乙醇中洗去多余的紅色→放入無水乙醇中3～5 min→用吸水紙吸干多余的乙醇→將切片放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各3～5 min→用中性樹膠封片，并在顯微鏡下觀察病理變化[28]。

1.4 數據處理

測定結果采用SPSS 17.0軟件進行統計處理，實驗數據以平均值±標準差表示。多組間差異顯著性比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），各組間比較用Duncan法。

2 結果與分析

2.1 不同處理組小鼠體質量變化

表1 小鼠體質量變化趨勢（n＝15）Table1 Change in body mass of mice (n= 15)g

如表1所示，在實驗前5 周，各組小鼠之間體質量無顯著性差異（P＞0.05），從第6周開始，除D-半乳糖衰老模型組小鼠體質量逐漸減少，其余組小鼠體質量均有所增加；第7周和第8周，除多糖低劑量組外，模型組與其他4 組小鼠體質量之間均有顯著差異。頸背部皮下注射8 周后，模型組小鼠行動遲緩，整日蜷成一團，精神萎靡，毛色灰暗，形體瘦弱，呈現出明顯衰老體征。說明D-半乳糖造成的衰老對小鼠體質量的改變有一定程度的影響，準噶爾山楂殘渣中的多糖對衰老小鼠體質量增長緩慢有良好的改善作用。

2.2 多糖類化合物對D-半乳糖衰老模型小鼠肝組織T-AOC、GSH-Px活力和MDA含量的影響

正常機體內的自由基生成和消亡處于動態平衡中，當平衡失調，體內積累的大量自由基會使機體產生衰老癥狀，目前由于機體衰老引起的肝硬化已成為人類第二大健康殺手，因此肝組織的抗氧化作用已成為檢測機體衰老程度的重要指標[29]。

圖1 體內肝組織抗氧化實驗結果Fig.1 Effect of the polysaccharides on T-AOC, GSH-Px activity and MDA content in liver

由圖1可以看出，隨著多糖劑量的增加，小鼠肝組織的抗氧化能力逐漸增強。與正常對照組相比，模型組的T-AOC極顯著降低（P＜0.01），GSH-Px活力顯著降低（P＜0.05），MDA含量極顯著升高（P＜0.01），說明造模成功[30]。與模型組相比，準噶爾山楂多糖中、高劑量組的T-AOC極顯著增強（P＜0.01），GSH-Px活力顯著升高（P＜0.05），MDA含量顯著降低（P＜0.05）。說明準噶爾山楂殘渣中的多糖能有效增強小鼠的肝組織抗氧化能力。

2.3 多糖類化合物對D-半乳糖衰老模型小鼠腦組織T-AOC、GSH-Px活力和MDA含量的影響

脂質過氧化損傷以及抗氧化酶在腦組織老化中有著重要的意義，腦組織的老化會影響腦的記憶功能，并出現學習功能障礙，腦損傷進一步發展成為阿爾茨海默病，所以腦組織中的抗氧化酶活力是機體衰老程度的又一重要指標[31]。

圖2 體內腦組織抗氧化實驗結果Fig.2 Effect of the polysaccharides on T-AOC, GSH-Px activity and MDA content in brain

由圖2可以看出，與正常對照組相比，模型組T-AOC有所降低，但差異不顯著（P＞0.05），MDA含量顯著升高（P＜0.05），GSH-Px活力極顯著降低（P＜0.01）。與模型組相比，多糖高劑量組小鼠腦組織T-AOC和MDA含量均極顯著變化（P＜0.01）。說明準噶爾山楂殘渣中的多糖可有效提高D-半乳糖致衰老小鼠腦組織中T-AOC、GSH-Px活力，同時能夠降低腦組織中的MDA含量，以清除體內的自由基等氧化性物質，對于D-半乳糖造成的小鼠衰老現象具有一定的延緩作用。

2.4 多糖類化合物對D-半乳糖衰老模型小鼠血清T-AOC、GSH-Px活力和MDA含量的影響

由圖3可以看出，不同劑量的多糖對D-半乳糖造成的小鼠衰老情況具有不同程度的改善作用。與正常對照組相比，模型組血清中T-AOC顯著降低（P＜0.05），GSH-Px水平極顯著降低（P＜0.01），MDA含量顯著升高（P＜0.05）。與模型組相比，多糖中、高劑量組T-AOC和GSH-Px活力均顯著增加（P＜0.05）；多糖高劑量組MDA含量極顯著降低（P＜0.01）。說明準噶爾山楂多糖類物質的添加可以改善由于D-半乳糖造成的衰老小鼠血清中T-AOC、GSH-Px活力降低，并一定程度上抑制血清中MDA含量的升高，進一步起到抗機體氧化的作用。

圖3 體內血清抗氧化實驗結果Fig.3 Effect of the polysaccharides on T-AOC, GSH-Px activity and MDA content in serum

2.5 多糖類化合物對D-半乳糖衰老模型小鼠胸腺和脾臟指數的影響

脾臟和胸腺是體內重要的免疫器官，當機體衰老時，免疫器官萎縮從而導致免疫功能降低。脾臟是機體最大的周圍淋巴器官，不僅是機體質量要的免疫應答場所，同時還擔任著機體重要的造血功能。胸腺質量及指數是胸腺在機體內大體形態的重要指標，因此胸腺和脾臟的衰老和萎縮間接反映了機體免疫系統的情況[32]。

從圖4可以看出，與正常組相比，模型組胸腺和脾臟指數變化不顯著（P＞0.05）；與模型組相比，不同劑量多糖組和VE對照組的小鼠胸腺指數和脾臟指數均有不同程度的增加，但差異均不顯著（P＞0.05）。說明準噶爾山楂多糖不會對動物的內臟造成損傷。

圖4 多糖對衰老小鼠胸腺和脾臟指數的影響Fig.4 Effect of the polysaccharides on thymus and spleen indexes of aging mice

2.6 肝臟病理學切片觀察

圖5 多糖對衰老小鼠肝組織的影響（×200）Fig.5 Effect of the polysaccharides on liver tissues in aging mice observed by HE staining (× 200)

由圖5可知，正常對照組（圖5A）肝小葉及肝細胞結構正常，肝索排列整齊，肝竇正常。模型組（圖5B）肝細胞及胞核體積縮小，染色程度增強，肝細胞之間連接松散，部分可見輕度脂肪變性。VE對照組（圖5C）肝細胞及胞核體積較衰老組增大，少量肝細胞胞漿內可見脂滴顆粒，肝索較寬，部分肝細胞可見雙核。多糖低（圖5D）、中劑量組（圖5E）肝細胞及胞核體積增大，部分肝細胞可見脂肪變性，尤以肝小葉周邊為重。多糖高劑量組（圖5F）肝細胞及細胞核結構、大小及其染色程度未見明顯異常，個別肝細胞胞漿內可見脂滴顆粒，肝索結構無明顯異常。說明準噶爾山楂殘渣中的多糖對D-半乳糖引起的衰老小鼠肝損傷有一定抑制作用。

2.7 海馬切片病理學觀察

圖6 多糖對衰老小鼠腦組織的影響（×400）Fig.6 Effect of the polysaccharides on brain tissues in aging mice observed by HE staining (× 400)

由圖6可知，正常對照組（圖6A）海馬神經元數量較多，神經元細胞形態結構清晰完整，大小均勻且列緊密整齊，細胞胞漿豐富，核仁清晰。模型組（圖6B）神經元數量減少，排列松散紊亂，邊界不清，胞漿少，細胞核固縮，少數神經細胞變性壞死，部分錐體細胞形態異常。VE對照組（圖6C）神經元數目形態正常，排列較為緊密，細胞結構清晰，變性壞死較少。多糖低劑量組（圖6D）神經元數量較少，排列疏松紊亂，細胞形態不規則，有少量細胞核固縮。多糖中劑量組（圖6E）神經元數量較低劑量組多，排列基本正常，邊界不清。多糖高劑量組（圖6F）神經元數量較多，排列緊密，邊界清晰，細胞核固縮少見。說明準噶爾山楂殘渣中的多糖對D-半乳糖致衰老小鼠海馬區神經元損傷有一定抑制作用。

3 結 論

通過對準噶爾山楂殘渣中的多糖進行粗提取后，給D-半乳糖衰老小鼠灌胃多糖物質，分析其對小鼠體內抗氧化酶活力和肝組織、海馬區神經元的影響。結果表明準噶爾山楂殘渣中的多糖可以使D-半乳糖衰老模型組小鼠的肝、腦組織和血清中GSH-Px活力、T-AOC上升，抑制MDA含量上升，并使模型組小鼠體質量上升。從細胞形態上看，與模型組相比，多糖中、高劑量組肝細胞和海馬區神經元細胞形態明顯好轉，神經元數量增加，細胞間隙變小，細胞核固縮情況減少，排列較模型組整齊，說明提取過花色苷后的準噶爾山楂殘渣中的多糖成分對D-半乳糖引起的小鼠衰老具有良好的延緩作用，對于預防氧化損傷具有明顯的促進作用，其綜合利用和開發值得重視。