普洱茶后發酵過程中多酚類成分生物轉化的研究進展

呂海鵬，王夢琪，張 悅，朱 蔭，林 智,*

（1.農業部茶樹生物學與資源利用重點實驗室，中國農業科學院茶葉研究所，浙江 杭州 310008；2.中國農業科學院研究生院，北京 100081）

黑茶是我國六大茶類之一，主要有普洱茶、茯磚茶、六堡茶、青磚茶及四川邊茶等類型，長期以來是我國邊疆少數民族同胞日常生活中重要的飲品[1]。普洱茶產于云南，是通過其加工原料（曬青毛茶）在高溫高濕的環境條件下經微生物參與的后發酵工藝制成的，因成茶具有特殊的風味品質和減肥降脂等保健功效，近年來遠銷東南亞及歐美市場，也引起了食品學、醫藥學、微生物學等相關領域科研工作者的關注[2-3]。多酚類成分是茶葉中的重要品質化學成分，它在茶葉中含量高且對茶葉風味品質和保健功效具有重要貢獻，長期以來一直是茶葉化學的研究焦點之一。現有研究表明，在后發酵過程中，曬青毛茶中的多酚類成分除了以氧化聚合和生物降解等為主的轉化方式外，還有少部分多酚類成分發生了化學結構修飾，由此形成了一系列對普洱茶風味品質及生物活性有重要影響的多酚類成分化學結構修飾產物。本文綜述了普洱茶中多酚類成分衍生物的研究進展情況。

1 多酚類成分在普洱茶后發酵加工過程中的變化

茶葉中的多酚類成分一般包括黃烷醇類（以兒茶素類為代表）、黃酮及黃酮苷類（以山柰酚、槲皮素以及楊梅素及其糖苷類為代表）、花青素和花白素以及酚酸類（酚酸和縮酚酸類化合物）等化學成分[1]。目前，人們已經針對綠茶、紅茶、烏龍茶以及白茶等非微生物發酵茶中的多酚類化學成分開展了較為系統的研究。然而，因為普洱茶以及其他黑茶中的多酚類化學成分在后發酵加工過程中涉及微生物參與的生物轉化過程，所以黑茶中的多酚類成分的化學結構和化學組成要比綠茶、紅茶和烏龍茶等更為復雜。研究表明，微生物參與的后發酵過程在普洱茶的品質形成中發揮了至關重要的作用[4-5]，奠定了普洱茶品質的化學物質基礎；許多微生物參與了普洱茶的后發酵過程，曲霉菌屬微生物被認為是普洱茶后發酵過程中的優勢菌種[6-8]，其中黑曲霉菌（Aspergillus niger）最受關注，它能生產多酚氧化酶、單寧酶、果膠酶、纖維素酶以及其他多種酶類[9]。在不同茶類化學成分比較方面，邵宛芳等[10]分析了紅茶、普洱茶及二者的加工原料——蒸青葉及青毛茶的水溶性多酚類物及其氧化產物，發現蒸青葉及青毛茶的色譜圖很相似，而紅茶與普洱茶的高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）譜圖截然不同；紅茶保留較多的未氧化多酚類，并含有一定量的黃酮糖苷（flavonol glycosides，FG）、茶黃酸（theaflavic acids，TFA）、茶黃素（theaflavins，TF）及茶紅素（thearubigins，TR）；而普洱茶只含有少量的未氧化多酚類物、FG及一定量的TR，且不含TFA及TF。

曬青毛茶中的多酚類成分在后發酵過程中的變化最為劇烈，含量呈現出明顯的降低趨勢，這已被許多研究證實。例如，羅龍新等[11]跟蹤研究了昆明茶廠生產普洱茶的過程，發現在渥堆結束后，茶多酚總量減少了60%以上，兒茶素含量則減少了80%左右。此外，李家華等[12]分析了曬青毛茶原料及其不同發酵階段翻堆樣中主要黃酮醇類物質含量的變化規律，發現它們的含量一直呈下降趨勢，發酵結束時出堆樣中楊梅素含量與原料相比下降近50%，槲皮素含量下降70%，而山柰酚含量下降62%。

由以上分析可見，在高溫高濕的渥堆環境條件以及微生物分泌的胞外酶的作用下，曬青毛茶原料中以多酚類成分為代表的眾多化學成分發生了一系列復雜的諸如氧化、聚合、縮合、分解等電化學變化，并由此可能形成了眾多新的化學物質成分。這些新的化學成分具有重要的研究價值，在一定意義上，它們可能有效促成了普洱茶獨特的風味品質特征（例如香氣陳醇、滋味醇厚、湯色紅褐等），并賦予了普洱茶重要的保健功效（例如降脂減肥等）。

發酵過程中多酚類成分含量大幅減少，其生物轉化的具體途徑和方式是什么？查明這個問題對于闡明普洱茶風味品質的形成及其化學本質具有重要價值。

2 普洱茶后發酵過程中多酚類成分生物轉化的主要可能途徑

圖1 普洱茶后發酵過程中多酚性化學成分的轉化[11-40]Fig.1 Microbial biotransformation of tea polyphenols during the pile fermentation of Pu-erh tea[11-40]

一般認為，曬青毛茶中的多酚類化學成分，在后發酵過程中的轉化途徑以氧化聚合（例如普洱茶中酚性成分的大量消失[11-12]和茶褐素的大量形成[13-14]）和生物降解（例如從表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）到表沒食子兒茶素（epigallocatechin，EGC）和沒食子酸（gallic acid，GA）[15-16]等）為主；此外，現有研究發現，還有少部分多酚類化學成分在微生物分泌的胞外酶的作用下發生了化學結構修飾（圖1）。已經證實，這些修飾產物在普洱茶風味品質化學以及生物活性中也發揮了重要作用，展現出重要的研究價值和研究意義。如圖2所示，歸納目前相關的文獻報道，普洱茶中多酚類成分化學結構修飾的主要類型至少包括以下幾種。

圖2 已經鑒定出的普洱茶部分多酚類成分的化學結構修飾產物[30-34]Fig.2 Identified derivatives of polyphenol compounds during the pile fermentation of Pu-erh tea[30-34]

2.1 糖基化（或脫糖基化）修飾

糖基化（或脫糖基化）修飾可能是曬青毛茶后發酵過程中多酚類成分生物轉化的一種重要方式。目前，普洱茶中大量的多酚類成分的糖苷化合物逐漸被鑒定出[2,17-19]。例如，張梁等[17]采用各種色譜技術進行分離，利用波譜法結合化合物的理化性質確定結構，在普洱茶乙酸乙酯萃取物中最終分離、鑒定了8 個黃酮類糖苷化合物，分別為山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷、山柰酚-3-O-β-D-蕓香糖苷、芹菜素6-C-α-L-阿拉伯糖-8-C-β-D-葡萄糖苷、牡荊素-4’-O-β-D-葡萄糖苷、山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖基（1→3）α-L-鼠李糖基（1→6）β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷、楊梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷；再如，福建省農業科學院采用HPLC-電噴霧電離四極桿飛行時間串聯質譜（HPLC coupled to electrospray ionisation and quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry，HPLC-ESI-QTOF-MS/MS）技術，從普洱茶中鑒定出了20 種黃酮成分的糖苷化合物，包含O-糖基化黃酮醇、C-糖基化黃酮、酰化糖基化黃酮醇等不同類型[19]；另外，郭雪梅等[20]研究發現，普洱茶茶褐素組分中存在著大量的糖信號；茶褐素組分是由槲皮素、山柰酚還有大量的糖構成的，茶褐素組分是可以結合1～4 個不同糖苷元，形成一系列以槲皮素和山柰酚為母核的黃酮氧苷化合物。隨著研究的深入，普洱茶中新的糖苷類成分不斷發現，例如2016年報道的槲皮素3-O-β-L-鼠李糖酰-（1→6）-（2-E-對香豆酰）-β-D-葡萄糖苷-4’-O-β-L-鼠李糖苷（quercetin 3-O-β-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-(2-E-p-coumaroyl)-β-D-glucopyranoside-4’-O-β-L-rhamnopyranoside）[21]和2017年報道的槲皮素-對香豆酰-鼠李糖酰-阿拉伯糖酰-己糖苷（quercetin-3-O-p-coumaroyl-rhamnosyl-arabinosylhexoside）[19]等。

在曬青毛茶的渥堆過程中，李家華等[12]發現總黃酮醇苷含量在整個發酵階段都呈極顯著減少趨勢，總黃酮醇苷含量從原料中的15.71 mg/g降到了渥堆結束時的5.32 mg/g；這種去糖基化修飾過程，可能是在發酵過程中微生物產生的糖苷酶水解黃酮糖苷生成楊梅素類、槲皮素類和山柰酚類之外的某些游離態黃酮醇苷元所致。茶葉中的黃酮醇類物質對其湯色和滋味等感官品質有顯著影響。研究發現，黃酮醇苷類呈柔和感澀味，且閾值極低，是紅茶中的重要澀味物質[22]；此外，槲皮素與綠茶茶湯色澤相關性較明顯（R＝0.764 7），而與紅茶的相關性更高（R＝0.848 6）[23]。在發酵過程中可以通過合理控制發酵時間、堆溫、發酵車間的濕度、微生物種群和數量等達到普洱茶黃酮醇類的均衡降解與轉化，保持成品茶中黃酮醇類的適度含量。保持其生物活性等是統一普洱茶品質、提高普洱茶質量的重要保證之一[12]。

2.2 甲基化修飾

甲基化修飾可能是普洱茶后發酵過程中多酚類成分生物轉化的另一種重要方式。目前的研究已經在普洱茶的揮發性成分和非揮發性成分中都鑒定出了一些多酚類成分的甲基化修飾產物，也證明了這些甲基化的修飾產物對普洱茶的風味品質和生物活性產生了重要影響。

在普洱茶的揮發性成分研究中，采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用（headspace solid-phase microextraction gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME/GC-MS）分析技術[24-25]，發現了大量的以1,2,3-三甲氧基苯、1,2-二甲氧基苯、3,4-二甲氧基甲苯、1,2,4-三甲氧基苯、1,2,3-三甲氧基-5-甲基-苯、4-乙基-1,2-二甲氧基苯、1-乙氧基-4-甲基-苯、1-甲氧基-4-（2-丙烯基）-苯、1,2-二甲氧基-4-（1-丙烯基）-苯以及1,2,4-三甲氧基-5-（1-丙烯基）-苯為代表的酚性甲氧基成分；并通過在線嗅聞技術，證明了這些甲基化成分是普洱茶“陳香”的關鍵致香成分之一；另外，這些成分一般被認為是在微生物作用和熱降解作用雙重作用條件下，通過GA的甲基化修飾形成的[26]。

在普洱茶的非揮發性成分中，也已鑒定出了一些多酚類成分的甲基化修飾產物，并發現這些甲基化的多酚類成分與普洱茶的生物活性可能存在著一定的聯系。例如，采用HPLC制備色譜等分析了普洱茶乙酸乙酯提取物E8組分（該組分被證實具有較強的抗氧化活性[27]）的化學成分，并通過LC-MS和核磁共振等對制備得到的化合物進行了結構鑒定，結果從E8組分中分離鑒定出3 個甲基化的黃酮化合物，分別為3’,4’,5-三羥基-7-甲氧基黃酮、3’,4’,7-三羥基-5-甲氧基黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷和3’,4’,7-三羥基-5-甲氧基黃酮[28]；另外，在對普洱茶降脂活性關鍵物質的研究中，從降脂活性最強的組分中采用HPLC-MS/MS技術鑒定出了一種甲基化的黃酮類成分（pollenitin）[29]。

2.3 主要發生在黃烷醇和黃酮醇A環上取代等方式的結構修飾

主要發生在黃烷醇和黃酮醇A環上取代等方式的結構修飾可能是普洱茶后發酵過程中多酚類成分生物轉化的第3種重要方式。通過發生在黃烷醇和黃酮醇A環上的取代等方式的結構修飾，形成了普洱茶中一些新的多酚類化學成分的結構修飾產物，這些衍生物成分往往是普洱中重要的標志性成分。歸納現有文獻報道，已經鑒定出的相關化合物主要有如下4 種類型：1）金雞納素型氧化黃烷醇類內酯化合物[30-31]：例如從普洱茶中鑒定出來的2 個新的8-C取代的黃烷-3-醇成分（puerins A和B）和2 個已知的金雞納素型多酚性成分：表兒茶素[7,8-bc]-4-（4-羥苯基）-二氫-2（3H）-吡喃酮（epicatechin-[7,8-bc]-4-(4-hydroxyphenyl)-dihydro-2(3H)-pyranone）和金雞納素lb。2）羧基和羧甲基取代的黃烷醇成分[32]：例如從普洱茶中鑒定出來的4 個新的羧基和羧甲基取代的黃烷-3-醇成分，即8-羧甲基-（+）-兒茶素（8-carboxymethyl-(+)-catechin）、8-羧甲基-（+）-兒茶素甲酯（8-carboxymethyl-(+)-catechin methyl ester）、6-羧甲基-（+）-兒茶素（6-carboxymethyl-(+)-catechin）以及6-羧基-（-）-沒食子兒茶素（6-carboxyl-(-)-gallocatechin）。3）苯丙素取代的黃烷醇成分[33]：例如從普洱茶中鑒定出來的4 個新的苯丙素取代的黃烷-3-醇成分（puerins C～F）。4）N-乙基-2-吡咯烷酮黃烷醇成分[34]：例如從普洱茶中鑒定出來的8 個新的N-乙基-2-吡咯烷酮黃烷醇成分（puerins I～VIII）。這類化合物可能來源于兒茶素和茶氨酸的結合衍生物，有潛力作為黑茶質量控制和真假辨別的生化指標。

此外，應該注意的是，另一種代表性的黑茶——茯磚茶，該類黑茶在后發酵過程中的化學結構修飾主要是發生在B環[35-37]。例如，從茯磚茶中分離鑒定出的5 種黃烷醇的衍生物成分，其中包括茯茶素A和茯茶素B，該成分為黃烷醇的8-環裂變內酯化合物。產生這種化學結構修飾差異性的原因，可能主要與微生物的組成差異有關，一般認為普洱茶后發酵過程中的優勢菌種為黑曲霉菌，而茯磚茶后發酵過程中的優勢菌種為冠突散囊菌。普洱茶和茯磚茶兩類黑茶，由于它們加工原料、渥堆發酵的微生物種類和加工工藝等方面的差異，研究發現它們的主要生化成分和生物活性也有較大區別[38]。

2.4 其他類型的分子修飾

其他類型的分子修飾可能是普洱茶后發酵過程中多酚類成分生物轉化的一種次要方式或者補充方式。現有的研究也報道了普洱茶中多酚類成分的一些其他類型分子修飾的化合物成分，這些成分也有可能是普洱茶中重要的品質化學成分。例如，采用現代植物化學方法從普洱茶中分離純化出的1 種重要的生物活性成分Teadenols A，研究發現它能促進脂肪連接蛋白的分泌以及抑制鉻氨酸磷酸酶的表達，也具有較強的清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基活性（半數抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）為64.8 μg/mL）、清除超氧陰離子自由基活性（IC50＝3.335 mg/mL）以及較強的總氧化活性（IC50＝17.6 U/mL）；此外，曬青毛茶（或普洱生茶）中一般不存在Teadenol A成分，在后發酵過程中該成分逐漸累積；它在22 個普洱茶中的含量介于0.17～8.15 mg/g[39]。另外，日本最近也報道了一些新的酚性色素成分[40]等。

GA是普洱茶中特征性的酚性化合物，也是重要的酚性化合物之一。除了上述GA的甲基化修飾產物外，普洱茶中還鑒定出了其他的一些酚酸化合物的化學結構修飾產物。例如，2,5-二羥基-苯甲酸、2-羥基-苯甲酸、4-羥基-苯甲酸、3,4-二羥基苯甲酸、1,3-苯二酚、4-甲基-1,2-苯二酚和1,2,4-苯三酚等化學成分[2]。在微生物活動的影響下，部分成分能夠被生物轉化為新的化學成分，例如3,4-二羥基苯甲酸可能是一種新的氨基化合物前體物質，N-（3,4-二羥基苯甲酰）-3,4-二氫苯甲酰胺（N-(3,4-dihydroxybenzoyl)-3,4-dihydrobenzamide）。

通過以上的分析可知，普洱茶后發酵過程中，在微生物分泌的胞外酶作用下，糖基化（或去糖基化）、甲基化以及其他類型取代方式的化學結構修飾可能是酚類成分生物轉化的一些重要途徑，以此形成了眾多的多酚類成分的化學結構修飾產物。這些結構修飾產物對普洱茶的風味品質和生物活性產生重要影響，成為了普洱茶的重要品質化學成分和標志性成分，具有重要的研究價值。

3 多酚類成分化學結構修飾產物的生物活性變化

多酚類化合物的生物利用度比較低，其生物轉化長期以來備受關注[41-44]。眾所周知，茶葉中的多酚類化合物，例如兒茶素成分及其氧化聚合產物茶黃素、茶紅素以及黑茶中大量形成的茶褐素等，生物利用度很低[45]，人們在努力嘗試多種途徑來有效提高其生物利用度。有研究表明，微生物參與的某些處理過程能在一定程度上顯著提高涉茶產品或提取物組分的生物活性[46-47]。因此，有理由推斷，黑茶后發酵過程中通過生物轉化形成的一些多酚類化合物的化學結構修飾產物可能有比較強的生物活性或者較高的生物利用度。這一點目前已經得到了初步的驗證[27]。

研究發現，酚性成分的糖基化、甲基化、酰基化等分子修飾反應，不僅增加了類黃酮物質的化學多樣性，同時也改變了原有酚性化合物的物理化學性質，從而使其生物活性也發生了一定的改變。例如，糖基化或者去糖基化修飾，從化學角度上說，黃酮類的糖基化修飾能提高藥效、溶解度、穩定性和藥代動力學性質[48-49]。一般意義上說，微生物傾向于將黃酮成分轉化成相應的3-O-配糖體和7-O-配糖體。對黃酮類化合物進行糖基化修飾已經成為獲得新的高活性以及低毒衍生物的重要方法。黃酮的糖苷類成分與普洱茶的滋味與色澤品質密切相關，是茶湯的關鍵滋味成分和關鍵呈色成分。再如，酚性成分的甲基化修飾，是通過在酚性成分的羥基部位進行甲基化修飾而形成的一類分子后修飾化合物，由于羥自由基發生甲基化，致使此類衍生物不易與硫酸鹽和葡萄糖醛酸結合，從而增加了在人體內的代謝穩定性；與此同時，甲基化也有利于增強酚類化合物的生物膜轉運能力，從而提高了其口服利用率和部分生物學活性。甲氧基類黃酮較類黃酮而言，可能通過降低羥基發生氧化作用而帶來的氧化脅迫，從而降低對細胞的毒副作用[50]。在羥基上進行甲基化是黃酮類物質的重要修飾反應，可以生成具有新的生物活性的甲氧基黃酮。例如，3’-O-甲基槲皮素具有較好的抗凝血活性[51]，而其另外兩種甲基化衍生物3-O-甲基槲皮素和7-O-甲基槲皮素均有較好的抗炎活性[52]。

通過以上分析可見，普洱茶后發酵過程中多酚類成分發生的這些如上所述的糖基化（或去糖基化）修飾、甲基化修飾、主要發生在黃烷醇和黃酮醇A環上取代等方式的結構修飾等化學轉化過程，可能直接促成了普洱茶中具有較高生物利用度的生物活性成分的形成，進而可以對普洱茶的保健功效產生重要影響。后續有必要挖掘后發酵過程中多酚類成分結構修飾形成的高活性成分。

4 多酚類成分結構修飾產物檢測分析方法的研究進展

目前普洱茶中只有極少數的多酚類化合物的結構修飾產物通過傳統的色譜純化技術得以發現和報道，而絕大多數的修飾產物的化學組成、風味品質特征以及生物活性等現在仍然是未知的。

在該類化學成分的鑒定方面，因這些成分的含量較低，且可能存在穩定性差的問題，傳統的色譜純化技術暫時很難有較大的突破。隨著現代科學技術的發展，先進的檢測分析技術手段，例如超高效液相色譜-Q-TOF-MS（ultra-performance liquid chromatography-Q-TOF-MS，UPLC-Q-TOF-MS）和全二維氣相色譜-飛行時間質譜（comprehensive two-dimensional gas chromatographytime-of-flight mass spectrometry，GC×GC-TOF-MS）等，已經在現代分析檢測中展現出了很強的優勢[53-54]，具有很大的潛力為解析普洱茶中多酚類成分化學結構修飾產物提供先進的技術支撐。例如，2011年，日本佐賀大學采用HPLC-Q-TOF-MS技術[55-56]，在黑茶中發現了一種普遍存在的多酚類成分的衍生物成分（Teadenols A和B），該成分是在微生物參與下形成的，是黑茶的一個特征性成分；他們認為HPLC-Q-TOF-MS技術十分適用于茶葉樣品中多酚類成分衍生物成分的鑒定與分析。2016年的一項研究中，也曾采用傳統的色譜分離純化方式鑒定出Teadenols A成分[39]。

此外，在該類成分的生物活性分析方面，一些更具生物相關性的細胞抗氧化法[57]以及HPLC-自由基清除檢測（radical scavenger detection，RSD）在線篩選體系等具有一定的優勢[58]，在多酚類成分的結構修飾產物的后續分析中可能具有較好的應用潛力。目前已有采用HPLC-DPPH技術分析茶葉活性成分的研究報道[59-60]，后續研究中，如果該類成分的分離純化存在較大的困難，可以首先考慮用HPLC-RSD在線篩選體系對其后行進行初步的評價，而后再根據具體情況選擇某些活性強的化學成分進行重點研究。

5 結 語

普洱茶中多酚類成分的化學結構修飾產物具有十分重要的研究價值和研究意義。在未來研究中，這些成分的主要研究思路可能至少包括以下幾個方面：采用傳統的色譜方法繼續鑒定重要的多酚類成分的化學結構修飾產物；采用UPLC-Q-TOF-MS和GC×GC-TOF-MS等分析技術手段解析普洱茶多酚類成分化學結構修飾產物；采用感官組學方法分析其風味品質特征；采用HPLC-RSD技術分析其生物活性；采用代謝組學等技術分析其形成機理；研發富含多酚類成分的化學結構修飾產物的深加工產品或保健食品。若將來條件成熟，可考慮將該類成分作為重要的生化指標之一，用來指導普洱茶的實際生產。