生乳中體細胞數對乳品質量安全的影響研究進展

蘇傳友，鄭 楠，李松勵*，屈雪寅，周雪巍，趙慧芬，杜兵耀，王加啟

（中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，農業農村部奶產品質量安全風險評估實驗室（北京），農業農村部奶及奶制品質量監督檢驗測試中心（北京），動物營養學國家重點實驗室，北京 100193）

乳中體細胞數是指每毫升乳中體細胞的個數。農業行業標準NY/T 800—2004《生鮮牛乳中體細胞測定方法》體細胞數的單位用“個/mL”表示[1]。生乳中體細胞主要是白細胞（淋巴細胞、巨噬細胞、多形核嗜中性白細胞），約占99%，還含有少量乳腺組織脫落的上皮細胞，約占1%[2-3]。體細胞數可以指示乳房炎[4]，通常反映生乳質量安全和乳畜健康狀況[5]。乳中體細胞數升高，抗生素和致病菌的潛在風險增加[6-7]。另外用高體細胞數生乳加工的奶粉在后續貯存過程中會產生異味[8]。因此，為了保證乳品安全和品質，許多國家對生乳中體細胞數規定了限量，將體細胞數作為生乳檢測的一項重要指標。而我國國家標準暫未對生乳中體細胞數規定限量。在我國奶業從安全向優質轉型的關鍵時期，研究生乳中體細胞數限量標準，對進一步提升我國生乳質量和安全具有重要意義。本文從體細胞數和乳品質量與安全的關系、不同國家對生乳體細胞數的限量及影響乳中體細胞數的因素和體細胞數檢測方法等方面作了綜述。

1 體細胞和乳品質量與安全的關系

1.1 體細胞對牛乳成分的影響

通常體細胞數增加會改變乳成分。史玉東[9]研究了體細胞數與牛乳化學成分的關系，發現乳中體細胞數升高可以顯著降低乳糖含量，而鈉和氯含量極顯著升高。牛乳蛋白質中以α-、β-、κ-酪蛋白等酪蛋白和β-乳球蛋白、α-乳白蛋白等乳清蛋白為主。體細胞數對牛乳中蛋白質影響較大，體細胞數增加會使牛乳中免疫球蛋白，如乳鐵蛋白和溶菌酶含量升高[10]，另外牛乳中纖溶酶和纖溶酶原會隨牛乳中體細胞數的增加而升高[11]；而酪蛋白及乳白蛋白含量降低[10]。有研究報道高體細胞數牛乳（84.9萬 個/mL）比低體細胞數牛乳（4.5萬 個/mL）蛋白和脂肪更容易降解[12]。牛乳體細胞數增加還能降低乳糖含量[13]。體細胞數對牛乳中C16:1脂肪酸單體、C4:0脂肪酸單體等和cis-9,trans-11-共軛亞油酸的含量有極顯著影響。同時，隨著體細胞數的增加，牛乳中多不飽和脂肪酸的相對含量顯著增加。多不飽和脂肪酸含量與牛乳中體細胞數呈極顯著正相關關系，而短鏈脂肪酸含量與體細胞數呈顯著的負相關關系[14]。

牛乳體細胞由多種類型細胞組成，會使牛乳中代謝物產生差異。Sundekilde等[15]用核磁共振技術研究了體細胞數對牛乳中代謝物的影響。研究發現，與低體細胞數牛乳相比，高體細胞數牛乳中乳酸、丁酸、異亮氨酸、醋酸、β-羥丁酸含量增加，而延胡索酸和馬尿酸鹽含量降低。Zhang Lina等[16]研究了高體細胞數對牛乳中蛋白質組的影響，發現體細胞數沒有改變牛乳中的蛋白質種類，而是改變了牛乳中不同蛋白質的表達量。與低體細胞數牛乳相比，高體細胞數牛乳上調的蛋白中，大多與免疫相關的如抗菌肽、α-1-微球蛋白、免疫球蛋白G2重鏈（immunoglobulin heavy constant gamma 2，IGHG2）、間-α-胰蛋白酶抑制劑重鏈H4（inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H4，ITIH4）、鈣結合蛋白S100A8，改變最顯著的是抗菌肽4。下調蛋白中，血小板糖蛋白4（glycoprotein IV，GPIV）、嗜乳脂蛋白亞家族1成員（butyrophilin subfamily 1 member，BTN1）A1和周脂素-2（perilipin-2，PLIN2）是與脂質合成和分泌有關的蛋白，ATP結合盒G亞家族成員2（ATP-binding cassette subfamily G member 2，ABCG2）是和牛乳分泌有關的蛋白，乳凝集素涉及細胞凋亡，CD59糖蛋白與免疫系統相關；其中血小板糖蛋白下調近20 倍。

1.2 體細胞數對牛乳風味和貨架期的影響

高體細胞數能夠降低牛乳風味，縮短貨架期。一方面，用高體細胞數的牛乳加工成巴氏殺菌乳后，冷藏過程中脂類分解較快，酸值大幅增加，產生哈喇味，感官品質下降，貨架期縮短[12]；另一方面，高體細胞數牛乳中纖溶酶、纖溶酶原、體細胞源蛋白酶濃度高，牛乳蛋白廣泛水解，使疏水多肽積累，產生澀味，導致牛乳貨架期縮短[17-19]。低體細胞數和高體細胞數生牛乳經巴氏殺菌后，在5 ℃貯存7、14、21 d，高體細胞數牛乳貯存過程中比低體細胞數牛乳酸值增長率高（P＜0.05）；巴氏殺菌乳冷藏21 d期間低體細胞數牛乳和高體細胞數牛乳酪蛋白都有降解，但高體細胞數牛乳酪蛋白/真蛋白下降幅度極顯著大于低體細胞牛乳（P＜0.01）；低體細胞數牛乳21 d冷藏后仍然能夠保持較高的感官品質，而高體細胞數牛乳表現出明顯的感官缺陷，主要包括酸敗、苦味和澀味；建議在乳品行業通過關注體細胞數對高品質牛乳生產者給予額外補貼，從而有利于提高液體乳品質[12]。同樣有研究報道，與低體細胞數牛乳相比，利用高體細胞數的牛乳加工酸奶同樣可以使脂肪分解，黏度和游離脂肪酸含量增加，貨架期縮短；用于生產酸奶的原料乳中體細胞數應該不超過40萬 個/mL，以防止在貯存過程中酸奶黏度的顯著變化[20]。此外，牛乳丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量與體細胞數呈極顯著正相關關系（P＜0.01），牛乳體細胞數升高可以使MDA含量升高，導致牛乳更容易氧化[21]。通常高體細胞數會導致體細胞中多性核嗜中性白細胞（polymorphonuclear neutrophil，PMN）的比例增加，由于PMN在脂肪降解中起著重要作用，因此高體細胞數牛乳脂肪降解率高[22]。

1.3 體細胞對乳品安全的影響

體細胞數不僅影響乳品質，還與乳品安全密切相關。體細胞數可以指示奶牛乳房炎，是衡量乳房炎的可靠指標。健康奶牛體細胞數通常較低，而乳房炎是導致乳中體細胞數升高的主要原因。乳房炎主要由細菌感染引起，乳中的體細胞數與革蘭氏陽性菌、葡萄球菌、鏈球菌、菌落總數呈正相關關系[6,23-24]。抗生素廣泛用于乳房炎的治療，Gonzalo等[7]對西班牙卡斯蒂利亞地區209 個牧場進行了5 年的調查，發現抗生素超標的乳中，體細胞數顯著升高。乳中高的體細胞數意味著高的微生物含量和抗生素殘留風險的增加。病原菌及其毒素能夠以乳為介質傳給消費者。抗生素殘留不僅影響發酵乳的加工，更會降低乳制品安全水平。在正常健康狀況下，牛乳中體細胞數一般不超過40萬 個/mL，隱性乳房炎奶牛乳中體細胞數不超過100萬 個/mL[25]。合理利用體細胞數，及時發現并治療奶牛的乳房炎和隱性乳房炎有助于提高乳品質量和安全。

2 生乳中體細胞數的限量

2.1 主要國家或地區生乳中體細胞數限量比較

體細胞數是衡量乳畜健康和生乳質量安全的重要指標，為了保障乳品質量和安全，許多國家對生乳中體細胞數規定了限量。本文整理了澳大利亞、加拿大、歐盟、美國等國家和組織對生乳中體細胞數的限量標準（表1）。不同國家和組織對牛乳中體細胞的限量不同，其中澳大利亞規定體細胞數為不超過20萬 個/mL[26]，加拿大和歐盟規定體細胞數為不超過40萬 個/mL[27-28]，美國規定不超過75萬 個/mL[29]。加拿大和美國都對山羊乳體細胞數也規定了限量，均為不超過150萬 個/mL[27,29]，美國還規定了綿羊乳中體細胞數限量為不超過75萬 個/mL[29]，澳大利亞對其他動物乳中體細胞的限量為不超過100萬 個/mL[26]。但GB 19301—2010《食品安全國家標準 生乳》[30]暫未對體細胞數規定限量。

表1 不同國家或地區對生乳體細胞數的限量[26-29]Table1 The limitation of somatic cell count set by different countries for raw milk[26-29]萬 個/mL

2.2 國外對生乳體細胞的監管

美國聯邦法規規定，對生乳中體細胞數測定應該在任何連續6 個月內，須接受至少4 次抽檢，并且這4次抽檢必須在不同的月份進行。若超過體細胞限量，則通知并警告生產者；若連續4 次抽檢中有2 次超過限量值，監管機構須通知生產者并予以書面警告，只要連續4 次抽檢中依然有2 次超過限量值，這個警告會持續有效[31]。

歐盟No. 853/2004[28]規定生乳中體細胞數測定每個月的樣品量不得低于1 批次；如果生乳中體細胞數不達標，食品經營者必須通知相關當局并采取有效的糾正措施。

2.3 中國對體細胞數的限量和要求

2.3.1 地方標準對體細胞數的限量

雖然我國國家標準暫未對乳體細胞數規定限量，但地方標準有對體細胞數規定了限量。T/HLJNY 001—2016《黑龍江省食品安全團體標準 生乳》對體細胞數規定了限量，根據體細胞數將生乳分為特級（≤30萬 個/mL）、一級（＞30萬～40萬 個/mL）和二級（＞40萬～50萬 個/mL）[32]。另外寧夏回族自治區地方標準DB64/T 1263—2016《生鮮牛乳質量分級》也根據體細胞數將生鮮牛乳分為特優品（≤20萬 個/mL）、優等品（≤40萬 個/mL）、一等品（≤60萬 個/mL）和合格品（≤75萬 個/mL）[33]。

2.3.2 其他關于體細胞數的要求

2000年2月15日，經上海市政府批準，上海市農委會同市質監局、市物價局和市衛生局聯合發布了《上海市生鮮牛乳質量管理暫行辦法》，該辦法規定了上海生鮮乳收購檢測涉及的“八項指標”，并將體細胞數納入了按質論價體系。體細胞計價方式見表2，上海市收購生鮮牛乳時，當體細胞數在40～75萬 個/mL時，既不獎勵也不減價；超過這一范圍按規定分別給予提價或減價。經過上海的按質論價后，上海生鮮乳中體細胞數下降明顯，從2006年的111.5萬 個/mL下降到2014年的57.01萬 個/mL（表3）[34]。另外周振峰等[35]統計了2007—2009年中國16 個省（市、區）的23 351 頭奶牛共225 775 份生乳體細胞數測定記錄，生乳中體細胞數總體均值為（48±117）萬 個/mL，其中不超過20萬 個/mL的占55.1%，不超過50萬 個/mL的占77.9%，不超過75萬 個/mL的占85.2%。中國奶業協會團體標準T/DAC 003—2017《學生飲用奶 生牛乳》中規定體細胞數應不超過40萬 個/mL[36]。

表3 2006—2014年上海生鮮乳體細胞數[34]Table3 SSC in raw milk from Shanghai during 2006-2014[34]

由于我國消費者對食品安全和質量的要求越來越高，我國奶產品質量和安全得到顯著提高。尤其是2008年三聚氰胺事件后，有關部門加大了對乳品安全的監管力度，近幾年奶牛管理水平的提高使牛乳質量得到了進一步提升。此外，為了提高牛乳質量和安全，提高國際競爭力，中國主要乳企對收購牛乳中體細胞數進行了嚴格的要求，一般的要求是不超過60萬 個/mL[37]。

3 影響體細胞數的因素

3.1 乳房感染或損傷

乳房炎是引起乳體細胞數增加的重要因素，當細菌感染、組織損傷或其他影響乳房組織的炎癥發生時，體細胞數顯著增加[38-39]，其中乳房內感染是影響乳中體細胞的主要因素。可以根據對乳房的感染能力將致病菌分為重要微生物和次要微生物兩大類，重要微生物如金黃色葡萄球菌、鏈球菌和大腸桿菌一旦感染，乳中的體細胞數會大量增加；而次要微生物主要為棒狀桿菌、凝固酶陰性葡萄球菌感染。de Haas等[40]以274 個牛場的2萬多頭奶牛為對象，研究了不同病原菌造成的乳腺感染對牛乳體細胞數變化的影響，研究結果表明，由大腸桿菌感染乳腺引起的乳中體細胞數變化在感染時出現高峰（150～200萬 個/mL），感染后下降較快；而被金黃色葡萄球菌感染的乳腺，乳中體細胞數高峰值較高（180～220萬 個/mL），且在感染后較長的一段時間內體細胞數不能恢復到正常水平。乳中體細胞數通常可以指示奶牛乳房炎，體細胞數與乳房炎的關系見表4[25]。

表4 生乳中體細胞數和乳房炎關系[25]Table4 Correlation between SSC and mastitis in raw milk[25]

3.2 胎次、泌乳期

通常隨著胎次的增加，奶牛患乳房炎的風險增加，導致體細胞數增加。Gaafar等[41]研究了胎次和泌乳期對牛乳體細胞數的影響，結果發現體細胞數隨著胎次的增加顯著增加（P＜0.05）；在分娩初期體細胞數較高，在泌乳前兩個月隨著泌乳期的延長，體細胞數下降，之后隨著泌乳期的延長，體細胞數逐漸增加。Mokhtar等[42]報道，隨著胎次的增加，牛乳中的體細胞數有增加的趨勢。

3.3 季節變化

通常夏季牛乳體細胞數高于冬季節牛乳體細胞數，因為在高溫、高濕季節（例如夏季）奶牛暴露病原體增加，更容易引起乳房感染，而在寒冷季節（冬季或春季）乳房感染的機率較小[43-45]。另外熱應激條件下可降低中性粒細胞的吞噬作用，使奶牛對乳房內感染的抵抗作用降低[46]。

3.4 管理

乳房潔凈度和乳區及擠奶設備和方式都會影響牛乳體細胞數。乳頭括約肌和乳腺導管是阻止病原菌進入乳房的主要生理屏障。奶牛乳房、下肢不潔凈，可使乳頭經常暴露在高密度病原菌環境中，使乳房炎感染幾率增加，造成牛奶體細胞數增加[47]。另外正常生理條件下不同乳區體細胞數差異顯著（P＜0.05），研究表明在生理條件下通常左前、右后兩個乳區體細胞數高于其他兩個乳區體細胞數[48]。

擠奶設備和擠奶程序對體細胞數也有顯著的影響。隨著奶牛養殖規模的擴大和旋轉式擠奶廳數量的增加，擠奶后乳頭自動化消毒的需求越來越大。與傳統噴灑或藥浴的養殖場相比，安裝自動乳頭藥浴和反沖裝置的牛場奶牛體細胞數顯著降低[49]。擠奶間隔和擠奶次數也會影響乳中體細胞數，一般一天擠兩次奶時，通常白天上、下午兩次擠奶間隔時間短，而下午和第2天上午擠奶時間間隔長，下午乳中體細胞數低于上午樣品中體細胞；另外，在擠奶過程中同一頭牛先擠出來的牛乳比后擠出的牛乳體細胞數低；在干奶過程中由2 次/d擠奶改為1 次/d或1 次/2 d，牛乳中體細胞數顯著升高[50]。

4 體細胞檢測方法

乳中體細胞數檢測方法可以分為直接法和間接法。直接法主要有顯微鏡法、熒光光電計數儀法、庫爾特計數儀計數法等；間接測定法主要有加利福尼亞細胞測定法（California mastitis test，CMT）、威斯康辛州乳腺炎試驗（Wisconsin mastitis test，WMT）、紅外熱成像法、pH值法等。直接法測出的結果與體細胞數相關性高，測出的結果更準確，而間接法測出的結果相關性稍差[51]。直接測定法通常自動化程度不高，工作量大或測定設備費用較高，不便普遍推廣，但檢測結果較準；間接測定法雖然具有操作方法較簡單、工作量小、成本低等特點，但精度較低[52]。中國農業行業標準NY/T 800—2004《生鮮牛乳中體細胞測定方法》提供了3 種生乳中體細胞數測定的方法，即顯微鏡法、熒光光電計數細胞儀法和電子粒子計數細胞儀法[1]。

4.1 直接測定法

直接顯微鏡細胞計數法是牛奶體細胞數檢測的標準方法[53]，原理是將測試的生鮮牛乳涂抹在載玻片上成樣膜，干燥、染色，顯微鏡下對細胞核可被亞甲基藍清晰染色的細胞計數[1]。該方法準確度較高，是校正其他體細胞數方法和儀器準確性的基礎[54]。

熒光光電計數細胞儀法的原理是樣品在熒光光電計數體細胞儀中與染色-緩沖溶液混合后，由顯微鏡感應細胞核內DNA染色后產生熒光的染色細胞，轉化為電脈沖，經放大記錄，直接顯示讀數。該方法重復性好、操作簡單、速度快，較適合測定大量牛奶樣品，但儀器價格較貴，且需經常校正[55]。

庫爾特計數儀法的原理是向樣品中加入甲醛溶液固定體細胞，加入乳化劑電解質混合液，將包含體細胞的脂肪球加熱破碎，體細胞經過狹縫，由阻抗增值產生的電壓脈沖數記錄并讀出體細胞數。該方法可以在短時間內直接讀出樣品中體細胞數，且結果準確，但前處理較復雜[56]。

4.2 間接測定法

CMT法的原理是利用表面活性劑（烷基芳基磺酸、溴甲酚紅紫等）和強堿破壞細胞膜，使體細胞釋放DNA等核酸物質，進而產生沉淀或形成凝塊，根據凝塊可估算體細胞數量。該方法只能將體細胞數劃分一個大致的范圍，無法確定體細胞具體數值[57]。

WMT法是在CMT基礎上建立的，原理基礎和CMT法類似，所用到的表面活性劑也一樣，但結果是測定值而不是估計值，比CMT法精度高[58-59]。

紅外熱成像法是根據受感染的乳房表面溫度和乳中體細胞數存在正相關關系，可用紅外熱成像儀在對乳房進行熱成像，依據溫度值和相關關系模型能夠估測出體細胞數，但在體細胞數小于40萬 個/mL時相關性較低，但用于隱形乳房炎的檢測較為準確[60-61]。

pH值法是通過牛乳pH值來判斷體細胞數，正常情況下牛乳pH值為6.5～6.8，隨著體細胞數的增加，pH值可能超過7.0[62]。用溴百里酚藍為指示劑，根據顏色值的不同可以區分乳房炎的類型或程度。劉文進等[63]建立了體細胞數與pH值的關系（表5）。該方法是一種定性方法，能夠較好地判斷隱形乳房炎[64]。

表5 生乳中體細胞數和pH值關系[63]Table5 Correlation between SSC and pH in raw milk[63]

5 結 語

近年來我國奶業發展迅速，已成為全球第三大原料乳生產國[65]。原料乳是保障和控制乳及乳制品質量安全的第一環，只有高質量的原料乳才能生產出高質量的乳制品。我國非常重視生乳的質量和安全問題，尤其是2008年三聚氰胺事件后，隨著監控力度加大以及優質乳工程的實施，我國乳及乳制品質量和安全不斷提高。

體細胞數作為評價乳房健康、生乳質量的有效指標，許多國家對其規定了限量；由于我國乳業發展起步較晚，目前國家標準暫未對生乳中體細胞數規定限量。近年來，隨著地方標準的出臺，以及我國許多乳品加工企業對收購的生乳中體細胞數進行了要求和監控，生乳質量和安全得到顯著提高。

希望我們能夠參考國內外限量標準，結合我國實際情況，制定出符合我國國情并有利于提高生乳質量和安全的體細胞數限量標準。同時希望所有養殖者能夠高度關注生乳中體細胞數，科學管理、規范飼養，產出質優量大的生乳，促進我國奶業壯大發展。