霍嘉穎,孫寶國,鄭福平,孫金沅,孫嘯濤,李賀賀,羅雪蓮,黃明泉,*
(1.北京工商大學食品學院,食品營養與人類健康北京高精尖創新中心,中國輕工業酒類品質與安全重點實驗室,北京 100048;2.中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所,北京 102206)
活性氧(reactive oxygen species,ROS)是超氧化合物陰離子自由基、羥自由基、過氧化氫、單線態氧、過氧化脂質和次氯酸鹽等物質的總稱。低濃度的ROS在細胞內信號傳導和防御病原體方面起著不可或缺的作用,而較高濃度的ROS會導致一些普遍的疾病和病癥,包括心血管疾病、關節炎、癌癥、糖尿病、動脈粥樣硬化、局部缺血、免疫力和內分泌功能障礙等[1-4]。為了防止機體的氧化損傷,可以通過機體內酶抗氧化系統(谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶(catalase,CAT))和非酶抗氧化系統(VC、VE、谷胱甘肽(glutathione,GSH)、類胡蘿卜素等還原性物質)有效清除ROS[5-6]。除了細胞自身調節之外,來自食物中的一些抗氧化活性物質也可以通過調節細胞內這兩種抗氧化系統或者抑制自由基的產生起到防止ROS積聚或將其從系統中消除的作用[7]。
許多動物和植物都富含天然存在的一些抗氧化劑,而目前動物蛋白作為抗氧化活性肽的重要來源已經被廣泛研究,例如在鵝蛋[8]、草魚[9]、泥鰍[10]等動物性蛋白來源中已發現了具有抗氧化活性的多肽。在天然植物中也存在許多具有抗氧化活性的物質,包括類黃酮、α-生育酚、VE、VC、甘露醇及GSH等,這些物質既可直接與ROS反應而將其還原,又可作為酶的底物在ROS的清除中發揮重要作用[11-12]。另外,在酒類飲料中也有很多關于抗氧化活性肽的研究。例如,2015年王正元等[13]以黍米黃酒為研究對象,分離純化得到了氨基酸序列為Cys-Gly-Ser-Pro的四肽,該四肽具有自由基清除功能,可以起到一定的抗氧化作用。2007年,Alcaide-Hidalgo等[14]從葡萄酒中分離出的酵母多肽,并對酵母多肽的血管緊張素轉化酶抑制活性和抗氧化活性(氧化自由基吸收能力法)進行了考察。但是,關于白酒中多肽的研究很少。2014年,Zhang Rong等[15]采用高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)分離結合四極桿-飛行時間質譜(quadrupole-time-of-flight mass spectrometer,Q-TOF-MS)與核磁共振檢測技術,分析鑒定出白酒體系中非揮發性特征成分地衣素,并剖析了地衣素影響小分子香氣化合物揮發性的作用機制。2016年,吳繼紅等[16]在白酒中發現一種多肽,具有明顯的抑制血管緊張素轉換酶活性的作用。而關于白酒中的抗氧化肽,目前僅有少量文獻有所報道,有研究發現來自芝麻香型白酒中的一種四肽具有細胞內抗氧化活性,可以對2,2’-偶氮雙(2-甲基丙脒)二鹽酸鹽(2,2’-azobis(2-methylpropanimidamidine) dihydrochloride,AAPH)誘導的人體肝癌HepG2細胞的氧化損傷起防護作用[17]。
抗氧化活性物質的評價方法目前主要有細胞模型法、體內法和體外法3 種:體外法是一種常用的方法,具有實驗周期短、成本低、重復性好等優點,但不能反映細胞內真實的生理條件[18];體內法(動物模型和臨床研究)是評估樣品抗氧化作用較好的方法,但其樣品用量大、成本高、實驗周期長;而采用細胞模型法評價物質的抗氧化活性,既可以符合機體真實的生理條件,同時也克服了動物模型成本高、實驗周期長等缺點,使得研究更經濟、快捷[7,19]。
本研究主要通過HPLC-Q-TOF-MS鑒定了從芝麻香型白酒中分離出來的一種三肽,同時利用AAPH誘導的HepG2細胞氧化損傷模型探究其細胞內抗氧化活性,為中國白酒的健康發展提供理論支持,也為今后健康白酒的研發提供一定參考。
芝麻香型白酒原漿酒(乙醇體積分數65%) 山東扳倒井股份有限公司;HepG2細胞 中國疾病預防控制中心;Arg-Asn-His(RNH)合成肽標準品(純度大于95%)吉爾生化(上海)有限公司;乙腈(色譜純,純度大于99%)賽默飛世爾(中國)公司;甲酸(色譜純,純度大于99%)北京迪科馬科技有限公司;胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、抗生素、AAPH 美國Sigma-Aldrich公司;微量丙二醛(malondialdehyde,MDA)、SOD、CAT、GSH-Px和總蛋白檢測試劑盒 南京建成生物技術研究所;ROS、GSH測定試劑盒 碧云天生物技術研究所;細胞計數試劑盒(CCK-8) 日本Dojindo公司;Dulbecco’s modified Eagle medium(DMEM)培養基 美國Corning公司;磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS) 上海源葉生物科技有限公司;無菌去離子水 北京索萊寶科技有限公司;胰蛋白酶美國Gibco公司;RIPA細胞溶解緩沖液 北京康為世紀生物科技有限公司;其他試劑均為國產分析純。
HPLC-Q-TOF-MS(HPLC型號為1290,Q-TOF型號為6530)、ZORBAX SB-C18反相色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)、100 μL自動進樣針、2.0 mL進樣瓶 美國Agilent公司;CCL-170B-8細胞培養箱 新加坡ESCO科技有限公司;SpectraMax M2e多功能酶標儀 美國Molecular Devices公司;TGL-20B-C高速臺式離心機 上海安亭科學儀器廠;熒光顯微鏡日本Nikon公司;SHB-III循環水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司;DKB-501A超級恒溫水槽 上海森信實驗儀器有限公司;RE-52AA旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠;FD-1B-80型冷凍干燥機 南京普森儀器設備有限公司;漩渦混合器 北京大龍興創實驗儀器有限公司;SL-N電子天平 上海民橋精密科學儀器有限公司;1.0 mL和200、100、10 μL移液槍 北京吉爾森科技有限公司;50~300 μL電動排槍 德國Eppendorf公司;Costa 96 孔板 美國Corning公司。
1.3.1 白酒前處理
量取5 L酒樣,采用旋轉蒸發儀在50 ℃、-0.1 MPa條件下濃縮至50 mL,殘留物用重蒸的乙酸乙酯萃取3 次,每次50 mL,將萃取后的水相凍干后用1.0 mL超純水復溶,置于-20 ℃冰箱內保存備用。
1.3.2 白酒中多肽的定性方法
將1.3.1節中處理的酒樣過0.45 μm濾膜后,置于1.5 mL進樣瓶中,采用HPLC-Q-TOF-MS鑒定該樣品中的多肽,多肽的氨基酸序列通過從頭測序算法(De novo)進行解析。
1.3.2.1 色譜條件
流動相A:超純水(含體積分數0.1%甲酸溶液),流動相B:乙腈(含體積分數0.1%甲酸溶液);洗脫程序:0~3 min,92%流動相A;3~15 min,92%~20%流動相A;15~20 min,20%~8%流動相A;20~25 min,8%~92%流動相A;25~30 min,92%流動相A;流速:0.5 mL/min;檢測波長:214 nm;柱溫:室溫(25 ℃);進樣量:10 μL。
1.3.2.2 MS條件
TOF模式:離子源:電噴霧離子源(electron spray ionization,ESI);掃描模式:正離子模式;干燥氣溫度:300 ℃;流量:8 L/min;噴霧器壓力:241.32 kPa;毛細管電壓:4 000 V;離子掃描范圍:m/z 100~1 000;采集速率:4 張質譜圖/s;裂解電壓:120 V;碰撞池電壓:0 V。
MS模式:離子源:ESI;掃描模式:正離子模式;干燥氣溫度:300 ℃,流量:8 L/min;鞘氣溫度:350 ℃,流量:12 L/min;噴霧器壓力:241.32 kPa;毛細管電壓:4 000 V;裂解電壓:120 V;碰撞池電壓:18 V;MS掃描范圍:m/z 50~1 000;采集速率:2 張質譜圖/s。
1.3.3 白酒中多肽的定量分析
采用外標曲線法對多肽進行定量分析,方法如下:用超純水配制質量濃度分別為0.01、0.10、1.00、5.00、10.00、25.00 mg/L的RNH標準品溶液,HPLC-Q-TOF-MS分析條件同1.3.2節。將經過前處理的酒樣同不同質量濃度的RNH標準品溶液在同等條件下采用MS掃描模式對目標母離子進行掃描,對積分峰面積與標準品質量濃度繪制標準曲線,然后根據標準曲線計算多肽的質量濃度。
1.3.4 多肽的細胞內抗氧化活性測定
1.3.4.1 細胞培養
HepG2細胞采用含有質量分數2.5% FBS和50 μg/mL抗生素(慶大霉素、青霉素和鏈霉素)的DMEM培養基,在5% CO2、95%空氣、37 ℃的濕潤培養箱中培養。每2 d更換一次培養基,待細胞融合度達到80%~90%時,使用質量分數0.25%胰蛋白酶和質量分數0.02%乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)溶液進行分離。為了避免FBS的干擾,在測定之前將平板更換為無FBS培養基。取對數生長期的細胞進行后續實驗。
1.3.4.2 多肽對HepG2細胞毒性的影響
為避免多肽對細胞存活率產生的影響,確定適合后續實驗的樣品濃度,將密度為1×105個/mL的細胞接種到Costa 96 孔板中,每孔加入100 μL細胞懸液,于37 ℃、5% CO2培養箱中貼壁培養24 h后進行實驗。實驗分為2 組,分別為樣品組和對照組,每組設置4 個孔。樣品組中加入10 μL質量濃度分別為12.00、8.00、4.00、2.00、1.00、0.500、0.250、0.125 mg/mL的多肽,對照組加入等體積的無FBS培養基,繼續培養24 h;之后各組每孔加入10 μL CCK-8,放置4 h后用酶標儀檢測波長450 nm處的OD值,并按照下式計算細胞存活率。

1.3.4.3 多肽對AAPH誘導氧化損傷的HepG2細胞中ROS的影響
實驗分為4 組,分別為樣品組、AAPH對照組、陽性對照組和空白組,每組設置4 個孔。樣品組加入100 μL質量濃度分別為1.00、2.00、4.00 mg/mL的多肽,以及含10 μmol/L 2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽(2’,7’-dichlor odihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA)的無FBS培養基,對照組和空白組分別加入100 μL不含樣品、含10 μmol/L DCFH-DA的無FBS培養基,在37 ℃培養箱中培養20 min后取出,棄去培養液后用無FBS培養基小心清洗細胞3 次。向樣品組和AAPH對照組加入100 μL濃度為200 μmol/L的AAPH溶液,向空白組加入等體積無FBS培養基,放入培養箱中繼續孵育3 h后取出,用熒光顯微鏡拍照,并使用熒光酶標儀測定熒光強度,激發波長488 nm、發射波長525 nm[17]。陽性對照組加入100 μL按體積比1∶1 000稀釋后的Rosup,放入培養箱中繼續孵育0.5 h后取出測定其熒光強度,測定條件同空白組。
1.3.4.4 細胞內MDA含量和抗氧化酶(GSH-Px、SOD、CAT)活力的測定
實驗分為3 組,分別為空白組、AAPH對照組和樣品組,每組設置4 個孔。將HepG2細胞以1×105個/mL的密度接種在Costa 24 孔板中,每孔加入1 mL細胞懸液,于37 ℃、5% CO2培養箱中貼壁培養24 h后進行實驗。棄去培養液,樣品組每孔細胞加入600 μL質量濃度分別為1.00、2.00、4.00 mg/mL的多肽,AAPH對照組和空白組加入等體積無FBS培養基,在細胞培養箱中孵育2 h,然后將細胞用PBS清洗兩次。為了誘導氧化應激,樣品組和AAPH對照組每孔均加入600 μL 200 μmol/L AAPH溶液,空白組加入等體積無FBS培養基,在細胞培養箱中孵育3 h后將細胞用PBS清洗3 次。用含有1 mmol/L苯基甲烷磺酰氟的RIPA裂解液在4 ℃裂解10 min,收集裂解后的細胞,在10 000×g條件下離心5 min獲得上清液。測定上清液中的MDA含量以及GSH-Px、SOD和CAT活力,以牛血清白蛋白為標準品定量測定細胞溶質中的蛋白質量濃度,按試劑盒說明書進行操作。
1.3.4.5 細胞內GSH濃度的測定
將HepG2細胞以1×105個/mL的密度接種在Costa 24 孔板中,每孔加入1.0 mL細胞懸液,于37 ℃、5% CO2培養箱中貼壁培養24 h后進行實驗。通過1.3.4.4節方法處理細胞。將加入600 μL 200 μmol/L AAPH溶液孵育3 h之后的細胞用質量分數0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液在37 ℃消化5 min,然后用PBS清洗2 次。加入含FBS的培養基終止消化,并將混合物在4 ℃下以10 000×g離心10 min,收集細胞碎片沉淀物。用蛋白去除試劑去除細胞碎片沉淀物中的細胞內蛋白,再將細胞碎片沉淀在-80~37 ℃之間快速循環兩次,然后將細胞碎片沉淀物在4 ℃保持5 min,以10 000×g離心10 min后獲得上清液。使用試劑盒測定細胞上清液中的GSH濃度。
對MS數據進行分析,提取離子色譜圖,發現保留時間為6.794 min處m/z 426.218 4([M+H]+)的組分峰面積最大,而且峰純度高。將m/z 426.218 4的離子作為母離子進行MS/MS分析,其離子色譜圖、MS圖及MS/MS圖如圖1所示。

圖1 多肽母離子m/z 426.218 4的離子色譜圖(A)、MS圖(B)和MS/MS圖(C)Fig.1 Extracted ion chromatogram (A), MS (B), and MS/MS (C) of m/z 426.218 4
為了得到多肽的氨基酸序列,根據文獻[10,17,20-23]報道的方法,采用從頭測序算法解析未知多肽的MS/MS碎片信息,確認其氨基酸序列。多肽通常在ESI-MS/MS條件下被質子化,當碰撞能量在10~200 eV時,多肽主要在酰胺鍵處發生斷裂,而側鏈的化學鍵在此低能量下較難發生斷裂,因此,MS/MS碎片離子主要是b離子和y離子[23]。
如圖1B所示,分析本研究得到的母離子m/z 426.218 4的MS/MS圖,推測m/z 270.091 9的碎片離子為y2離子,可能是Asn-His;推測m/z 271.121 3的碎片離子為b2離子,可能是Arg-Asn;推測m/z 156.093 7的碎片離子為y1離子,可能是His;推測m/z 157.137 7的碎片離子為b1離子,可能為Arg。綜上所述,確定m/z 426.218 4的多肽氨基酸序列為Arg-Asn-His。其結構如圖2所示。

圖2 RNH結構式Fig.2 Structure of RNH
本研究采用外標法對RNH進行定量分析,標準曲線的方程為y=142 567x-51 242(R2=0.997 7),計算出白酒中RNH質量濃度為(18.78±0.34)μg/L。
2.3.1 RNH對HepG2細胞毒性的影響

圖3 RNH質量濃度對HepG2細胞存活率的影響Fig.3 Effect of RNH concentration on viability of HepG2 cells
如圖3所示,當RNH質量濃度在4.00 mg/mL以內時,隨著樣品質量濃度的增加,細胞死亡率基本沒有變化;但當RNH質量濃度達到4.00 mg/mL時,細胞死亡率顯著增加(P<0.05),表明在此質量濃度下HepG2細胞已經受到損傷,但是存活率依舊在80%以上,可以視為細胞在此條件下能正常存活。為了考察不同RNH質量濃度對細胞抗氧化性的影響,選擇3 個質量濃度1.00、2.00、4.00 mg/mL作為后續實驗的樣品質量濃度。
2.3.2 RNH對AAPH誘導的氧化損傷HepG2細胞內ROS的影響
AAPH是一種偶氮化合物,在37 ℃下可以自發分解產生自由基。其產生的自由基與氧立即發生反應而引起脂質氧化[24]。細胞膜脂質的氧化降解可導致其喪失完整性,同時導致運輸機制產生缺陷并且增加細胞膜的滲透性,使得AAPH可滲透細胞膜進入細胞內部,引起ROS的產生[25]。因此,用AAPH誘導氧化應激,通過細胞內ROS的濃度來反映HepG2細胞的氧化損傷是一種有效方式。
本研究利用熒光探針DCFH-DA進行ROS檢測。DCFH-DA本身沒有熒光,可以自由穿過細胞膜,進入細胞后,可以被細胞內的酯酶水解生成沒有熒光的DCFH,而DCFH不能透過細胞膜,而且可以被細胞內ROS氧化為具有熒光的7’-二氯熒光素(7’-dichlorofluorescein,DCF),根據DCF熒光強度即可知細胞內ROS水平[26-27]。

圖 4 RNH對AAPH誘導的氧化損傷HepG2細胞內ROS的影響Fig.4 Effect of RNH on intracellular ROS in HepG2 cells with AAPH-induced oxidative damage
如圖4A所示,空白組未經AAPH處理,顯示出比較弱的熒光,說明細胞沒有受到氧化損傷。相比而言,AAPH對照組熒光較強。與AAPH對照組相比,經過不同質量濃度RNH預處理的樣品組表現出了較弱的熒光,說明多肽在一定程度上降低了細胞內ROS水平。為了避免人眼主觀性的差異,用酶標儀對細胞內熒光強度進行測定,結果如圖4B所示。與AAPH對照組相比,加入不同質量濃度的RNH顯著減少了ROS產生(P<0.05),而且呈濃度依賴性。這表明用RNH處理后的HepG2細胞受到部分保護,可防止其受到氧化損傷,而且RNH的質量濃度越高,保護效果越好。
2.3.3 多肽對細胞內MDA含量的影響
細胞膜降解的一個重要步驟是ROS與多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid,PUFA)的雙鍵反應,產生脂質過氧化氫,引發脂質過氧化作用,并因此形成脂質過氧化物[28]。MDA是一種由過氧化PUFA(主要是花生四烯酸)斷裂形成的三碳化合物,是脂質過氧化的主要產物之一[29]。因此,MDA含量可以反映機體內過氧化程度,從而間接反映細胞損傷程度。

圖 5 RNH對細胞內MDA含量的影響Fig.5 Effect of RNH concentration on intracellular MDA
如圖5所示,與空白組相比,經過200 μmol/L AAPH處理3 h后的HepG2細胞中MDA含量顯著增加(P<0.05)。與AAPH對照組相比,用不同質量濃度RNH預處理2 h后均對細胞內MDA含量有所抑制:其中低質量濃度(1.00 mg/mL)RNH處理后的HepG2細胞中MDA含量為1.08 nmol/mg,其對細胞內MDA的抑制率為45.24%;而高質量濃度(4.00 mg/mL)RNH處理后的細胞內MDA含量為0.24 nmol/mg,其抑制率為88.10%,且與正常細胞相比無顯著性差異(P>0.05)。以上結果表明,RNH對AAPH誘導的HepG2細胞內氧化損傷具有一定的保護作用,且具有抗氧化活性。
2.3.4 RNH對AAPH誘導的HepG2細胞中GSH濃度的影響
GSH是細胞內非常重要的一種非酶系統抗氧化劑,是體內清除ROS的一種重要物質,對于維持機體的氧化還原平衡意義重大。GSH濃度的減小表明機體發生了強烈的氧化應激反應,因此抗氧化劑保護細胞氧化損傷的一種有效途徑就是減少細胞內GSH的消耗[23,30]。

圖 6 RNH對AAPH誘導的氧化損傷HepG2細胞內GSH濃度的影響Fig.6 Effect of RNH concentration on intracellular GSH
如圖6所示,與空白組相比,加入AAPH之后GSH濃度顯著降低(P<0.05),說明AAPH對細胞造成了氧化損傷,細胞為了抵御氧化損傷,導致GSH被消耗。但是,在加入RNH對細胞進行預培養之后,再加入AAPH進行氧化損傷,其GSH濃度均顯著高于AAPH對照組(P<0.05)。可見,RNH可以提高HepG2細胞中的GSH濃度,減少AAPH誘導的氧化損傷,具有一定的抗氧化能力。
2.3.5 RNH對細胞內GSH-Px、SOD、CAT活力的影響
作為酶促系統中重要的抗氧化劑,細胞內GSH-Px、SOD、CAT 3 種酶主要通過間接清除自由基的方式減少對GSH的消耗,提高其自身活力從而抑制過氧化反應[19]。其中SOD可以清除人體內的自由基,催化O2-·形成H2O2和O2,而CAT和GSH-Px可將H2O2轉化為H2O,三者都是哺乳動物體內重要的抗氧化酶,其中SOD被認為是防止氧化損傷的關鍵酶,具有獨特的生物活性。因此,可以將抗氧化酶活力的變化作為細胞抗氧化應激的生物性標志[12,31]。

表 1 RNH對AAPH誘導的氧化損傷HepG2細胞內CAT、GSH-Px和SOD活力變化的影響Table1 Effect of RNH on GSH-Px, SOD and CAT activities in HepG2 cells with AAPH-induced damage
如表1所示,與空白組相比,使用AAPH處理3 h可顯著抑制GSH-Px、SOD和CAT活力(P<0.05),其抑制率分別為60.00%、47.33%和48.37%,表明AAPH處理增加了HepG2細胞內的氧化應激。RNH組與AAPH對照組相比,GSH-Px、SOD和CAT活力都有所提升,低質量濃度組分別增加32.14%、57.79%和27.85%,中質量濃度組分別增加96.42%、138.94%和244.30%,高質量濃度組分別增加250.00%、280.22%和560.76%。以上結果表明,多肽對AAPH誘導的氧化損傷HepG2細胞氧化應激具有保護作用。Du Yichen[32]和Wang Liying[33]等的研究發現,肽具有抗氧化能力,其可以通過改善細胞內重要抗氧化酶(GSH-Px、SOD和CAT)的活力來保護細胞免受氧化應激的相關損傷。在本研究中,RNH也通過增加GSH-Px、SOD和CAT 3 種抗氧化酶活力,有效地激發了HepG2細胞的抗氧化酶系防御系統,減少氧化應激損傷。
多肽的抗氧化性主要與其氨基酸組成、排列順序、分子質量大小及其空間結構等相關。由于His結構中含有的咪唑基團具有良好的供電子和供氫能力,因此具有良好的自由基清除能力。據報道,咪唑基團能抑制脂質過氧化,如Chen Huaming等[34]從大豆β-伴球蛋白水解產物中鑒定出6 個肽,其中4 個含有His,這些肽均能抑制脂質過氧化。另外,Escudero等[35]從火腿中鑒定出一系列多肽,發現含有His的肽段SSAHT和IHSGSVG也都具有一定的抗氧化能力,并指出這是序列中His的貢獻。另外,也有研究表明His能促進血紅素的SOD活力[36-37],從而發揮其抗氧化作用。因此,本研究從白酒中分離鑒定出的多肽RNH的抗氧化性也可能是His的貢獻。
本研究利用HPLC-Q-TOF-MS在芝麻香型白酒中鑒定出一種三肽RNH,通過AAPH誘導的HepG2細胞氧化損傷模型,發現該三肽具有一定的細胞內抗氧化活性,不僅可以提高機體內還原性物質GSH的濃度,清除細胞內ROS,而且能夠提高細胞內抗氧化酶(GSH-Px、SOD、CAT)的活力,同時可以防止MDA含量的增加,降低細胞中AAPH誘導的脂質過氧化水平,從而提高細胞的抗氧化能力。
目前已報道的白酒中具有生物活性的多肽還很少,本實驗結果不僅可以為功能性白酒的研究提供一定的參考,而且可以為食源性生物活性肽在白酒工業中的應用提供一定的依據。今后將繼續對白酒中的各種健康因子進行研究,尤其是不同香型白酒的功效將是主要研究目標。