鮑魚肽的制備及其抑制人乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖作用

陳申如，魏配曉，葉燕軍，陳 俊,2，翁武銀,2,*

（1.集美大學食品與生物工程學院，福建 廈門 361021；2.廈門市海洋功能食品重點實驗室，福建 廈門 361021）

福建鮑魚資源豐富，養殖產量約占全國鮑魚總產量的80%[1]。伴隨著消費者飲食觀念的改變和市場的需求，干鮑、冷凍蒸煮鮑和罐頭鮑等鮑魚加工產品逐漸增加。在鮑魚加工過程中，必然會產生約占鮑魚質量25%的內臟。鮑魚以攝食海藻和浮游生物為生，內臟富含蛋白、多糖、脂質、微量元素和各種活性代謝物。因此，近年來有關鮑魚內臟活性成分的研究逐漸受到關注。鮑魚內臟不僅含有豐富的?；撬醄2]，而且鮑魚內臟酶解物及其膜分離組分、鮑魚內臟多糖均具有良好的抗氧化活性[3-5]。具有抗氧化活性的寡肽能明顯抑制乳腺癌細胞和胃癌細胞的增殖[6-7]。有研究報道，鮑魚內臟蛋白多糖可能通過增強荷瘤小鼠的免疫功能抑制H22肝癌，鮑魚內臟蛋白肽在一定程度上能抑制肝癌細胞的生長增殖[8-9]。然而，有關利用鮑魚內臟提取蛋白肽對乳腺癌細胞增殖作用的影響卻鮮見報道。

乳腺癌是全球女性最常見惡性腫瘤之一，近年來隨著環境、生活方式的改變及人口老齡化加劇，我國女性人群乳腺癌患病率也呈上升趨勢[10]。然而，越來越多的研究資料表明，從食品加工副產物中提取的營養物質也可抑制乳腺癌細胞的生長[11-13]。因此，本實驗以鮑魚內臟為原料，通過蛋白酶解、膜分離技術制備蛋白肽，并以不同質量濃度鮑魚肽處理人乳腺癌MDAMB-231細胞，考察細胞的增殖抑制、誘導凋亡效應和作用機制，為利用鮑魚內臟制備蛋白肽、開發輔助抗腫瘤功能性食品提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮑魚內臟由廈門市島之原生物科技有限公司提供。

人乳腺癌細胞（MDA-MB-231細胞） 中國科學院昆明細胞庫；高糖培養基（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM）、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS） 美國Gibco公司；雙抗（青霉素/鏈霉素）、胰酶（質量分數0.25%） 美國Corning公司；四甲基偶氮唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）細胞增殖檢測試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；Calcein-AM細胞活性分析試劑盒 南京建成生物工程有限公司；細胞周期檢測試劑盒、細胞凋亡檢測試劑盒 上海碧云天生物技術有限公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）美國MP生物科技有限公司；臺盼藍（質量分數0.4%）美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

UV-8000A型紫外分光光度計 上海元析儀器有限公司；1200高效液相色譜儀 美國Agilent公司；Forma 702二氧化碳培養箱 美國Thermo公司；EVOS型倒置顯微鏡 美國AMG公司；Cytoflex流式細胞儀 中國貝克曼庫爾特商貿有限公司；Series II Water Jaket酶聯免疫檢測儀 美國BMG公司。

1.3 方法

1.3.1 鮑魚肽的制備

在鮑魚內臟中，按照料液比為1∶5加入蒸餾水，搗碎，加入鮑魚內臟質量2‰的胰酶，用質量分數1% NaOH溶液調整pH值至8.0，50 ℃條件下酶解6 h，然后用體積分數1% HCl溶液將酶解液的pH值調整至5.5，加入鮑魚內臟質量1‰的木瓜蛋白酶，在50 ℃條件下繼續酶解12 h。酶解液利用100 ℃滅酶10 min，將離心（8 000 r/min，10 min）獲得的上清液利用截留分子質量為1 000 Da超濾膜進行超濾，獲得的濾液再利用200 Da納濾膜進行脫鹽濃縮，獲得200～1 000 Da的濾液組分通過冷凍干燥制備成鮑魚肽，備用。

1.3.2 鮑魚肽基本組分的測定

蛋白質質量分數采用GB/T 5009.5—2010《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》的凱氏定氮法進行測定，蛋白質的換算系數為6.25；碳水化合物質量分數采用GB/T 15672—2009《食用菌中總糖含量的測定》的苯酚-硫酸法進行測定；灰分質量分數的測定采用GB/T 5009.4—2016《食品安全國家標準 食品中灰分的測定》的高溫灼燒法進行測定；水分質量分數采用GB/T 5009.3—2010《食品安全國家標準 食品中水分的測定》的直接干燥法進行測定。

1.3.3 鮑魚肽分子質量分布的測定

蛋白肽的分子質量分布參考Weng Wuyin等[14]報道的方法進行測定，利用凝膠滲透色譜進行測定。色譜柱為TSKgel G2000 SWxL（300 mm×7.8 mm，5 μm），流動相為乙腈-水-三氟乙酸（體積比45∶55∶0.1），在柱溫30 ℃、流速0.5 mL/min的條件下，以檢測波長為214 nm對樣品進行測定。

1.3.4 細胞培養

參考文獻[13]的方法，將MDA-MB-231細胞在含質量分數10% FBS和質量分數1%雙抗的DMEM培養液中，于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養箱中培養，每隔2～3 d換培養液一次，待細胞融合率達90%時，用質量分數0.25%胰蛋白酶消化，并進行傳代培養，取對數期生長狀態良好的細胞供以下實驗使用。

1.3.5 細胞存活率測定

細胞存活率參考Oh等[15]報道的方法進行測定。MDA-MB-231細胞以5×104個/孔接種于96 孔板中，放在37 ℃、5% CO2的條件下培養24 h后，吸棄上清液并加入含不同質量濃度鮑魚肽的培養液繼續培養48 h。培養結束后，吸棄培養液，加入100 μL MTT（0.5 mg/mL）染色，于37 ℃下繼續培養4 h，然后移去培養液，加入110 μL DMSO溶解藍紫色結晶，用酶聯免疫檢測儀于490 nm波長處測各孔的吸光度，按照下式計算細胞存活率。

1.3.6 Calcein-AM染色

Calcein-AM染色參照Haorah等[16]報道的方法進行測定。按1.3.4節的實驗方法，細胞經過含不同質量濃度鮑魚肽的培養液培養后，吸棄培養液，每孔加入100 μL Calcein-AM溶液（2 μmol//L），避光室溫反應20 min后，置于熒光顯微鏡下觀察活細胞情況。

1.3.7 細胞凋亡檢測

按照試劑盒操作說明書，以Annexin V-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）雙染色法對細胞凋亡進行檢測。按1.3.4節方法，細胞經過含不同質量濃度鮑魚肽的培養液培養后，吸棄培養液，每孔分別加入100 μL含質量分數1% AnnexinV-FITC和質量分數1% PI溶液的工作液，避光室溫反應10 min后，用流式細胞儀測定細胞凋亡情況。

1.3.8 細胞周期檢測

按照試劑盒操作說明，以PI單染法對細胞周期進行檢測。按1.3.4節的實驗方法，細胞經過含不同質量濃度鮑魚肽的培養液培養后，用胰酶消化，磷酸鹽緩沖液洗滌，離心（1 000 r/min、5 min）收集細胞，加入預冷的無水乙醇進行固定，-20 ℃過夜，再通過離心（1 000 r/min、5 min）并用磷酸鹽緩沖液洗去乙醇后，加入核糖核酸酶A和PI染色液，在37 ℃下避光水浴30 min后進行流式細胞檢測，并用軟件對細胞周期進行分析。

1.4 數據分析

數據采用SPSS 17.0統計軟件進行單因素方差分析，差異顯著（P＜0.05）采用Duncan氏法進行多重比較檢驗。

2 結果與分析

2.1 鮑魚肽的理化性質

鮑魚內臟經蛋白酶解、超濾和納濾制備成淡黃色的蛋白肽，其基本成分經檢測為：蛋白質（71.62±1.23）%（質量分數，下同）、碳水化合物（3.38±0.04）%、灰分（11.48±2.38）%、水分（6.41±0.18）%。蛋白肽除了主要成分蛋白以外，還含有少量碳水化合物，表明鮑魚內臟中的蛋白經胰酶和木瓜蛋白酶酶解后形成的小肽能透過1 000 Da超濾膜，而多糖幾乎都被超濾膜截留。通常，納濾處理不僅具有濃縮效果，還可起到良好的脫鹽效果。周鳳娟等[17]利用納濾設備進行絲素蛋白酶解液進行脫鹽，結果發現干燥后的絲素肽中灰分質量分數為2.34%。然而，在本研究中鮑魚內臟酶解液雖然經過納濾膜處理，但是在獲得鮑魚肽中灰分質量分數卻高達11.48%，表明鮑魚肽對礦物質元素具有良好的螯合能力。

圖1 鮑魚肽的分子質量分布Fig.1 Molecular mass distribution of peptides derived from abalone viscera

分子質量檢測的結果顯示，鮑魚肽中蛋白分子質量主要分布在350～1 000 Da范圍內，豐度較高的蛋白肽分子質量分布在350 Da 附近（圖1），表明獲得的鮑魚肽主要是由2～3 個氨基酸殘基組成的小肽。據報道，寡肽尤其二肽或三肽容易穿越小腸黏膜被人體吸收利用[18-19]。因此，本研究制備的鮑魚肽也可能有效地被人體吸收，從而發揮其生物活性功能。

2.2 鮑魚肽對細胞存活率的影響

圖2 鮑魚肽對MDA-MB-231細胞存活率的影響Fig.2 Effect of peptides derived from abalone viscera on cell viability of MDA-MB-231 cells

從圖2可以看出，隨著培養液中鮑魚肽質量濃度的增加，乳腺癌MDA-MB-231細胞的存活率呈下降趨勢。當培養液中鮑魚肽的質量濃度為8 mg/mL時，乳腺癌MDA-MB-231細胞存活率只有45%左右。這些結果表明，鮑魚肽對乳腺癌細胞的增殖抑制作用顯著（P＜0.05），而且呈劑量依賴性。

2.3 細胞形態學觀察

圖3 MDA-MB-231細胞形態學觀察Fig.3 Morphological change of MDA-MB-231 cells

如圖3所示，在自然光條件下觀察時，可以發現乳腺癌MDA-MB-231細胞在未添加鮑魚肽的培養基中貼壁良好，呈梭形分布。伴隨培養基中鮑魚肽質量濃度的增加，貼壁細胞逐漸減少，且部分細胞出現染色加深（細胞核濃縮）、回縮變圓等現象。這與Mirakabadi等[20]報道的利用蛇蝎毒液提取的肽抑制MDA-MB-231細胞時的現象一致。另一方面，在熒光條件下觀察到的鮑魚肽質量濃度對MDA-MB-231活細胞形態的影響與自然光條件的趨勢一致，只是在熒光條件下更清晰。不管是在自然光條件下還是在熒光條件下，當培養基中含有的鮑魚肽質量濃度不小于4 mg/mL時，視野內活細胞的數目（圖3）明顯低于MTT法檢測的數據（圖2）。MTT法檢測細胞存活率是利用活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶還原MTT生成水不溶性的藍紫色結晶甲瓚，在490 nm波長處檢測溶解在二甲基亞砜中的甲瓚[21]。琥珀酸脫氫酶活性除了與活細胞數量有關外，還與外界干預后細胞的狀態有關[22]。在細胞晚期凋亡和壞死情況下，線粒體的功能都受損，會導致MTT檢測的吸光度偏低[23]。因此，鮑魚肽對MDA-MB-231細胞增殖的實際抑制效果應該高于MTT法檢測的結果。

2.4 鮑魚肽對細胞凋亡的影響

在流式Annexin V-FITC/PI雙參數中，I、III、II和IV象限分別代表機械損傷細胞、活細胞、晚期凋亡/壞死細胞和早期凋亡細胞[24]。由圖4可以發現，對照組的MDA-MB-231細胞早期凋亡率和晚期凋亡率分別為1.96%和4.05%，而1、2、4、8 mg/mL鮑魚肽處理48 h的MDA-MB-231細胞早期凋亡率分別為12.01%、21.43%、5.09%和1.96%；晚期凋亡率分別為14.74%、32.25%、48.33%和72.65%。這表明鮑魚肽能誘導乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡和壞死，進而抑制腫瘤細胞增殖，并呈現出明顯的質量濃度梯度依賴性。

圖4 流式細胞儀檢測MDA-MB-231細胞凋亡率Fig.4 Apoptosis rates of MDA-MB-231 cells determined by flow cytometry

2.5 鮑魚肽對細胞周期的影響

利用流式細胞儀對不同質量濃度鮑魚肽處理的MDA-MB-231細胞的細胞周期分布進行檢測。隨著鮑魚肽的質量濃度的增加，可以發現G1期細胞數減少，S期細胞數增加，G2期細胞數在鮑魚肽質量濃度8 mg/mL條件下顯著增加（圖5），表明鮑魚肽主要將MDA-MB-231細胞阻滯在S期，從而達到抑制乳腺癌細胞增殖的目的。通常，細胞從一次分裂完成到下一次分裂開始一般會經歷細胞間期（G1期、S期和G2期）和分裂期。一旦細胞進入分裂期，細胞周期就會不可逆轉地進行下去。有研究表明，小肽可以進入癌細胞，激活抗癌基因p53，進而誘導癌細胞的凋亡[25]。低分子質量的小肽，可以調動、增強機體的抗腫瘤機制，減弱、抑制促腫瘤生長機制，進而抑制腫瘤的生長繁殖[26]。而且，小肽中的陽離子會與癌細胞細胞膜的陰離子發生特異性的結合，從而使細胞發生裂解[27]。因此，MDA-MB-231細胞周期被阻滯在S期說明細胞DNA合成受抑制或DNA損傷無法得到修復，結果導致細胞無法進行分裂增殖（圖2）。

圖5 鮑魚肽對乳腺癌細胞MDA-MB-231細胞周期的影響Fig.5 Effect of peptides derived from abalone viscera on cell cycle in MDA-MB-231 cells

近年來，鮑魚內臟的綜合利用和活性物質提取的研究，日益引起各國學者的關注。有研究表明，鮑魚內臟酶接物中苯丙氨酸、酪氨酸和天冬氨酸等具有抗氧化活性的氨基酸質量分數可以高達57.1%，它們可以通過清除細胞內的自由基保護肝細胞免受氧化應激[28]。鮑魚內臟酶接物通過系列凝膠層析分離可以獲得具有良好抗血管緊張素轉化酶活性的三肽（Ala-Met-Asn）[29]。黑鮑內臟酶解物經過FPLC分離后可以獲得具有抗血栓和抗凝血功能的活性物質[30]。然而，有關鮑魚內臟制備的蛋白肽對乳腺癌細胞增殖抑制的研究卻鮮見報道。因此，本研究的結果將為鮑魚內臟的高值化利用拓展新的應用范圍。

3 結 論

本研究利用鮑魚內臟，通過酶解、超濾和納濾制備成淡黃色的鮑魚肽，結果發現制備的蛋白肽中還含有少量的碳水化合物和高含量的礦物質。以乳腺癌MDA-MB-231細胞為模型，研究了制備的鮑魚肽的抗增殖活性和促細胞凋亡作用，結果表明鮑魚肽對MDA-MB-231細胞增殖有顯著的抑制作用，并呈現出劑量依賴效應。運用流式細胞術發現，鮑魚肽能顯著誘導乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡，而且細胞周期發生了變化，主要被阻滯在S期和G2期，進而抑制MDA-MB-231細胞的增殖。本研究的結果表明，鮑魚內臟可以用于研發具有輔助抗腫瘤功能的蛋白肽產品。