白羽肉雞胸腿肉的氧化對食用品質和鈣蛋白酶活性的影響

鄧凱波，黃雅萍，許正金，傅靈韻，鄭寶東,*

（1.福建農林大學食品科學學院，福建 福州 350002；2.中國愛爾蘭國際合作食品物質學與結構設計研究中心，福建 福州 350002；3.福建省特種淀粉品質科學與加工技術重點實驗室，福建 福州 350002；4.福建正大食品有限公司，福建 龍巖 364000）

白羽肉雞是我國肉雞產品的重要組成部分，也是肉雞屠宰加工企業的主要原料。因其具有高蛋白、低膽固醇、低脂肪和低熱量等特點，已成為世界各地消費者普遍接受的優質動物蛋白質來源。但在規模化屠宰加工過程中，白羽肉雞的保水性和質構特性（彈性、咀嚼性、凝聚性等）相比其他肉類還有待提高[1]，這制約著我國白羽肉雞產業的發展[2]。目前已有研究表明，豬、牛等大型動物的肌肉汁液損失與氧化應激有關[3]，但氧化應激在禽肉中研究較少。

在肉類加工和貯存過程中，溫度、光、射線、氧等外界環境均會導致肌肉發生氧化，主要引起水、蛋白質和脂質等宏量營養素的水平變化[4-5]。研究表明，持水性與宰后肌肉蛋白質的降解有關[6]，而蛋白質氧化是發生在脂類氧化之后的第二階段反應[7]，主要為活性氧物質（如羥自由基、肌紅蛋白自由基或脂類次級氧化產物等）引起的如肽鍵斷裂、側鏈修飾、蛋白質分子間共價交聯（如二硫鍵）以及組氨酸（His）殘基轉變等一系列蛋白質結構變化[8]，從而導致包括骨架蛋白、抗萎縮蛋白和整合蛋白等的肌肉蛋白質降解，造成蛋白纖維網絡結構破壞，形成水分轉移通道，導致汁液流失、肌肉嫩度變差[9-10]，并進一步影響肌肉中脂類及相關活性酶的水平。而肌肉中的不易流動水則會在肌肉僵直和成熟過程中，隨著肌肉結構和pH值的變化而變化，這也是汁液損失的主要原因[11]。

由于肌肉持水性能與嫩度密切相關[12]。作為參與肉質嫩化的主要酶系，鈣蛋白酶I（μ-calpain）和鈣蛋白酶II（m-calpain）表達量的上調會使肌肉蛋白發生水解導致肉質嫩度增加，表明鈣蛋白酶的水解作用是導致肉質嫩化的主要因素。因此鈣蛋白酶在肌肉中的濃度是肉類嫩度的一個重要預測指標[13]。而在氧化應激條件下，肌肉纖維蛋白及活性酶均發生不同程度的氧化變性和活性下降。現有蛋白質氧化應激方面的研究主要集中在豬和牛等大型哺乳類動物[14-15]，家禽方面報道較少。因此，研究白羽肉雞的持水性影響因素對于研究禽類肌肉汁液損失的控制手段和提高我國白羽肉雞企業市場競爭力具有重要意義。

本研究從高、低兩個氧化水平出發，探討氧化對白羽肉雞不同部位肌肉持水性能的影響，及其對肌肉蛋白質和脂類營養素氧化程度的作用；并研究氧化條件下肌肉鈣蛋白酶水平變化及與持水能力的相關性，以期為解決白羽肉雞產業中氧化控制問題提供理論支持，并為企業降低經濟損失和提高產品價值提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

飼養管理相同的6 周齡或體質量2.0～2.5 kg的AA白羽肉雞6 只 福建正大食品有限公司；三羥甲基氨基甲烷鹽-酸鹽（tris(hydroxymethyl)aminomethane-HCl，Tris-HCl）、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、乙酸、β-巰基乙醇、KCl、CaCl2和酪蛋白等試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

5804R高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；BT125D電子分析天平、pH計 德國Sartorius公司；DHG-9075A數顯電熱恒溫鼓風干燥器、HWS-26水浴鍋上海一恒科技有限公司；HG04-TP101型食品中心溫度計北京北信未來電子儀器有限公司；JY92-II型超聲細胞破碎儀 寧波新芝生物工程有限公司；UV-2601型紫外-可見分光光度計 北京瑞利分析儀器公司；DS-1型組織搗碎機 上海標本模型廠。

1.3 方法

1.3.1 原料預處理

以白羽肉雞胸肉和腿肉為研究對象，在宰后24 h內分離、單獨冷凍并分裝，于-20 ℃冷庫中存放。使用時，隨機選取分裝樣品并置于4 ℃中至自然解凍后，分別割取中心部位質量約為100 g肉塊進行后續實驗。

1.3.2 樣品氧化處理

參考劉澤龍[16]關于肉氧化處理的方法，并做適當改動。取上述肌肉樣品12 塊，用紙巾吸干表面水分后，每4 塊為一組，分別置于3 組不同水平的Fenton氧化體系（FeCl3/抗壞血酸/H2O2）中，模擬肌肉氧化，溶液成分如下：

低氧化水平體系：15 mmol/L哌嗪-1,4-二乙磺酸（piperazine-1,4-bisethanesulfonic acid，PIPES）緩沖液，1、5、10、20 mmol/L H2O2，0.1 mmol/L抗壞血酸，0.01 mmol/L FeCl3，0.1 mol/L NaCl，pH 6.2，氧化時間為1 h。

高氧化水平體系：15 mmol/L PIPES緩沖液，20、30、40、50 mmol/L H2O2，0.1 mmol/L抗壞血酸，0.01 mmol/L FeCl3，0.1 mol/L NaCl，pH 6.2，氧化時間為5 min。

空白對照：15 mmol/L PIPES緩沖液，0.1 mol/L NaCl，pH 6.2，氧化時間為1 h和5 min。

氧化反應的終止：在體系中加入終濃度為1 mmol/L的EDTA終止氧化，反應時間5 min。氧化反應終止后立即將樣品取出，靜置瀝水5 min后，立即進行后續指標測定。

1.3.3 肌肉持水力的測定

隨機取樣（精確記質量m0/g）置于底部墊有紗布的50 mL離心管中，在2 000×g、4 ℃下離心20 min后記質量（m1/g），之后將離心后的樣品置于烘箱中，在105 ℃下干燥至質量恒定，測定除去水分后的肌肉質量（m2/g）。持水力由公式（1）計算。

1.3.4 蒸煮損失率的測定

隨機取一定質量（m1/g）肌肉樣品置于80 ℃恒溫水浴中加熱，當樣品中心溫度達60 ℃立即取出，流水冷卻至室溫，吸干樣品表面汁液后稱質量（m2/g）。每次測定3 個重復。蒸煮損失率計算見公式（2）。

1.3.5 產品得率的測定

方法同1.3.4節測定蒸煮損失率，產品得率計算見公式（3）。

1.3.6 蛋白質氧化水平的測定

因氧化后的肌肉蛋白會因氧化型自由基的攻擊而發生羰基化現象，故蛋白質羰基化可作為衡量氧化程度的指標之一，因此采用2,4-二硝基苯肼（2,4-dinitrophenyl hydrazine，DNPH）法測定[17]。樣品蛋白質含量采用Bradford法測定[18]。

1.3.7 脂質過氧化水平的測定

參照孟少華等[19]所述方法：將10 g氧化后待測樣品和對照樣分別研細，加50 mL含0.1 g/100 mL EDTA的體積分數7.5%三氯乙酸溶液，振搖30 min后雙層濾紙過濾2 次。取5 mL濾液，加入5 mL 0.02 mol/L的1,2-硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）溶液，沸水浴中保溫40 min，取出冷卻1 h后，以1 600 r/min離心5 min，取上清液加5 mL氯仿搖勻，靜置分層后吸取上清液，分別在532 nm和600 nm波長處測定吸光度，用公式（4）計算硫代巴比妥酸反應產物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）值，單位以每千克肉中丙二醛（malondialdehyde，MDA）的質量來表示。

1.3.8 鈣蛋白酶活力的測定

白羽肉雞胸肉的鈣蛋白酶粗酶液的提取和活力測定參照謝婷[20]所述方法進行，其中鈣蛋白酶的活力以每克肌肉樣品中的酶活力來表示，即在25 ℃下水解酪蛋白1 h可使278 nm波長處吸光度增加1.0所需的酶量，用公式（5）計算鈣蛋白酶活力。

1.4 數據統計分析

每項指標均進行3 次重復測定，并設置相應的對照組。采用Microsoft Office Excel 2007和Origin 9.2軟件進行數據處理和單因素方差分析，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 氧化對雞肉持水力水平的影響

圖1 氧化應激對雞胸肉和腿肉持水力水平的影響Fig.1 Effect of oxidation treatment on water-holding capacity of broiler breast and drumstick meat

由圖1可知，與對照組相比，胸肉和腿肉的處理組持水力均有不同程度降低。10 mmol/L和20 mmol/L H2O2處理1 h，以及50 mmol/L H2O2處理5 min后，持水力均顯著下降（P＜0.05），且兩組氧化濃度處理的持水力變化趨勢相似。說明氧化使肌肉組織內部原本穩定其水分的能力遭到破壞，這可能與肌原纖維蛋白質結構發生變化有關。

肌肉中大部分水分存在于肌原纖維及肌球蛋白粗纖絲和肌動蛋白/原肌球蛋白細纖絲之間的間隙中，肌原纖維間隙中的水分構成了汁液流失的主要組成部分[21]。氧化可造成肌原纖維蛋白質表面的疏水性殘基暴露，使蛋白質結構發生變化、蛋白交聯程度發生改變，從而導致肌纖維之間間距的改變，造成肌原纖維間的空間內原有水分的流失[22-23]。

2.2 氧化對雞肉蒸煮損失率和產品得率的影響

圖2 氧化應激條件對雞胸肉和腿肉蒸煮損失和產品得率的影響Fig.2 Effect of oxidation treatment on cooking loss and yield of broiler breast and drumstick meat

由圖2可知，隨著H2O2濃度的升高，各處理組蒸煮損失率逐漸增大，產品得率逐漸降低，這同樣與氧化造成的肌原纖維蛋白質變化有關[23]。

此外，與腿肉結果相比，胸肉蒸煮損失率較小，說明水浴加熱后胸部肌肉組織的內部水分含量更高，這可使其嫩度更高、口感更好，各處理組的胸肉得率也遠高于相同條件下的腿肉得率。這是由于兩個部位肌肉在來源、肌纖維類型和蛋白組成等方面存在差異[24]，其中胸部肌肉蛋白質凝膠能力更強，受熱前較長的肌纖維形成的網絡結構使其聚集能力更強[25]；因此具有更好的受熱保水能力，嫩度更高。這也與消費者對于胸肉相對較嫩、腿肉相對較柴的習慣感官經驗相一致。

2.3 氧化對肌肉蛋白羰基水平的影響

蛋白羰基水平是蛋白氧化的標志之一。由圖3可知，H2O2濃度與蛋白羰基濃度呈顯著正相關關系，即隨著氧化程度的加深，肌肉蛋白質羰基化程度越高。但與低濃度H2O2長時氧化處理相比，高濃度H2O2短時氧化處理對肌肉蛋白羰基濃度的影響更為顯著（P＜0.05）。說明在此條件下，H2O2濃度對蛋白羰基生成速率的影響更加顯著。同時，將雞胸肉用20 mmol/L H2O2分別氧化處理5 min和60 min，蛋白羰基濃度分別為0.85 nmol/g和1.24 nmol/g。說明在此H2O2濃度下，延長氧化時間會提高樣品中蛋白羰基含量。而在同一氧化水平下，雞胸肉和腿肉的蛋白羰基水平基本相同，無顯著差異（P＞0.05）。

肉雞在屠宰、加工和貯存期間，肌原纖維蛋白易受氧化，特別是蛋白質氧化和脂類氧化，從而引起氨基酸被破壞、肽鍵斷裂、蛋白交聯等，并會生成蛋白-脂類氧化產物等復合物[26]，這會直接影響到肌肉持水性能，影響肉雞食用品質和經濟效益[16]。已有研究證明，總蛋白羰基水平與牛肉的剪切力顯著相關[27]。本研究也發現，白羽肉雞胸腿肉的蒸煮損失率與蛋白羰基水平均隨H2O2濃度升高而增加。蛋白氧化可降低牛肉的嫩度，但蛋白羰基水平與白羽雞肉嫩度之間的確切機制尚不明確[26]。

2.4 氧化對脂質過氧化水平的影響

不同氧化處理對白羽肉雞胸肉和腿肉的脂類氧化情況如圖4所示。在相同氧化條件下，白羽肉雞的胸肉和腿肉脂質過氧化水平無顯著差異（P＞0.05），而TBARS值隨H2O2濃度升高而增加，各處理組的TBARS值與對照組相比均有顯著升高（P＜0.05）。這是由于肉類在氧化過程中產生的活性氧簇可以與肌細胞中的多不飽和脂肪酸和核酸等大分子物質發生脂質過氧化反應，形成如MDA的脂質過氧化產物，故本研究中不同的H2O2濃度使肌肉的脂質過氧化程度產生差異。

但在不同氧化時間的處理組（1 h和5 min）中，與高濃度H2O2短時氧化處理相比，低濃度H2O2長時氧化處理對肌肉的影響更為顯著（P＜0.05）。前者的TBARS值明顯隨H2O2濃度的增加而上升（P＜0.05）；而后者生成的TBARS值較前者有所下降但仍與H2O2的濃度呈正相關。由于醛類等脂質過氧化產物是蛋白羰基化反應的底物之一[28]，所以高濃度氧化處理可能導致其因底物消耗而導致MDA的正向合成速度加快；同時也與高H2O2濃度條件下蛋白羰基水平較高的結果相一致（圖3B）。此外，雞胸肉經20 mmol/L H2O2氧化處理5 min后的TBARS值為0.53 mg/kg，而氧化處理1 h后的TBARS值升至1.14 mg/kg，可見在該時間范圍內，氧化時間越長，脂質過氧化程度越深。

2.5 氧化對肌肉鈣蛋白酶活力的影響

鈣蛋白酶是影響白羽肉雞肌肉品質的特征性酶系，直接關系到持水性能和嫩度等指標。有研究表明，宰后雞胸、腿肉的總鈣蛋白酶水平無顯著差異[29]，且胸肉因其更穩定的凝膠特性[25]，為研究食用品質的特征性部位之一，故采用胸肉進行鈣蛋白酶的氧化研究。

圖5 不同氧化處理對肌肉鈣蛋白酶活力的影響Fig.5 Effect of oxidation treatment on calpain activity of broiler breast and drumstick meat

不同氧化條件對雞胸肉鈣蛋白酶活性影響如圖5所示。經過兩種不同濃度的氧化處理，發現在氧化體系中鈣蛋白酶活力均隨H2O2濃度升高而逐漸降低。所有氧化濃度的鈣蛋白酶活力均與對照組具有顯著差異（P＜0.05），且相隔處理組的酶活力均具有極顯著差異（P＜0.01），說明活性氧對鈣蛋白酶活力具有非常大的影響。且相同H2O2濃度（20 mmol/L）下，鈣蛋白酶活力也隨氧化時間延長而顯著降低。

肉類屠宰后成熟階段，鈣蛋白酶被激活，降解細胞骨架蛋白，肌纖維收縮時產生的交聯及肌原纖維之間的交聯斷裂，使胞內重新獲得水分貯存的彈性空間，持水力提高。Huff-Lonergan等[30]指出，豬肉的氧化會抑制鈣蛋白酶的活力。這與雞胸肉處理組較對照組的鈣蛋白酶活力顯著降低的結果相一致（P＜0.05）。其原因可能是因為鈣蛋白酶的活性位點含有His和Cys殘基，易因自由基的供給而活性降低甚至失活[9]。研究發現，鈣蛋白酶可造成肌原纖維蛋白質發生降解，將導致組織完整性喪失，嫩度提高[20,31]。而在氧化環境中，肌原纖維的皺縮作用直接導致外層連接的細胞膜同時收縮，從而使間隙中的水分因無法貯存而流失，這與本研究中氧化對持水性能研究結果相對應，推測白羽肉雞中鈣蛋白酶的酶活力水平與白羽肉雞肉質改變的關系密切。

3 結 論

本實驗通過對不同氧化應激水平下白羽肉雞胸腿肉的持水性能、蛋白質和脂質氧化程度等食用品質及鈣蛋白酶活力變化進行了研究與分析，得到以下結論：氧化可造成肉雞胸肉和腿肉持水力下降，蒸煮損失率增加，產品得率降低，且隨著H2O2濃度升高，胸腿肉的持水性能顯著下降（P＜0.05）。其中，與胸肉相比，腿肉的蒸煮損失率和產品得率受氧化應激的影響更大，主要可能是由胸肉和腿肉的蛋白凝膠結構差異所致。同時，氧化還導致肌肉蛋白質和脂質等營養素發生明顯過氧化現象，H2O2高濃度短時處理比低濃度長時處理對肌肉蛋白羰基水平的影響更為顯著，而對TBARS值影響恰好相反。但相同條件下，胸肉與腿肉之間結果差異并不顯著（P＞0.05）。氧化對肌肉鈣蛋白酶活力具有非常大的影響，其酶活力水平隨H2O2濃度升高而逐漸降低，從而推測鈣蛋白酶活力水平與白羽雞肉肉質改變的關系密切。這說明在白羽肉雞的加工、貯藏中要避免其受到氧化影響，加強氧化抑制機制的研究。目前，在對氧化與肌肉持水能力的研究中，主要集中在肌原纖維蛋白功能變化和蛋白水解酶活力（如鈣蛋白酶等）等方面，其他影響因素還有待深入研究。