硬毛地筍酚類化合物對DNA損傷的保護作用

郭 琦，高春燕*

（大理大學公共衛生學院，云南 大理 671000）

硬毛地筍（Lycopus lucidus Turcz.）又名蟲草參、地參，為唇形科澤蘭屬多年生草本植物，具有很高的營養及保健功效，是藥食兼用的佳品，享有“植物珍品”、“山中之王”的美稱，曬干后可入藥，其功能與冬蟲夏草相似[1]。硬毛地筍資源豐富，主要分布在云南昆明、大理、麗江等少數民族聚居地區，以大理地區分布最為廣泛，且品質最優。已有的研究表明該屬植物的主要成分有揮發油、黃酮類、酚類、三萜類、糖類及酸類化合物[2-5]，具有很好的抗菌、抗氧化、降血脂、降血糖等多種生理功效[6-16]。大量的研究表明，酚類化合物是良好的還原劑、金屬離子螯合劑、單線態氧淬滅劑及供氫體，具有較強的抗氧化活性[17-25]。

DNA是生命的重要遺傳物質，控制細胞的增殖與分化。自由基是帶有未成對電子的分子與離子，具有較高的反應活性。細胞內產生的自由基可以攻擊DNA，造成嚴重的DNA氧化損傷，進而引起遺傳物質的改變。其中，過氧自由基（ROO·）可對DNA、蛋白質、脂質、糖類等生物大分子造成嚴重的氧化損傷，導致細胞凋亡與組織損傷，進而引起多種疾病的產生，如癌癥、慢性炎癥、心血管疾病、神經退行性疾病等。王長松等[26]曾對5 種中藥酚酸類化合物體外抗DNA損傷的作用進行研究，但有關硬毛地筍酚類化合物對DNA損傷保護作用的研究尚鮮見報道。本實驗通過體外2,2-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽（2,2-azobis(2-methylpropionamidine)dihydrochloride，AAPH）引發ROO·損傷pBR322質粒DNA模型，對硬毛地筍酚類化合物保護ROO·介導的DNA損傷作用進行研究，旨在為硬毛地筍及天然抗氧化劑的開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

硬毛地筍：分別于2016年11月16日（T1）、2016年12月15日（T2）和2017年1月14日（T3）采于云南大理劍川縣沙溪鎮四聯村，洗凈烘干、粉碎，凍存備用。材料經大理大學藥學與化學學院中藥研究所鑒定為唇形科澤蘭屬多年生草本植物硬毛地筍（L. lucidus Turcz.）。

咖啡酸、迷迭香酸、沒食子酸、福林-酚試劑、水溶性VE（Trolox）、pBR322質粒DNA 美國Sigma公司；甲醇、冰乙酸（色譜純） 美國Thermo Fisher公司；甲醇、乙酸乙酯、AAPH、Tris、瓊脂糖均為國產分析純。1.2 儀器與設備

Scientz-ND系列真空冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司；WFJ 2000型紫外-可見分光光度計上海尤尼科儀器有限公司；1200高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀、ZORBAX SB-C18色譜柱 美國Agilent公司；DYY-6C型電泳儀 北京市六一儀器廠；Image Quant 300 CCD凝膠成像分析系統 美國通用電器公司。

1.3 方法

1.3.1 硬毛地筍酚類化合物的提取

參考文獻[27]的方法，稍作修改后進行提取。準確稱取硬毛地筍粉末5 g，用體積分數80%甲醇溶液于室溫下超聲波輔助提取3 次，每次10 min，合并濾液，旋轉蒸發除去甲醇。水相用HCl溶液將pH值調節至1～2，然后用乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯相，旋轉蒸發除去乙酸乙酯，剩余殘留物冷凍干燥，得游離酚（free phenolics，FP）提取物。FP提取后所得殘渣加入NaOH溶液（含乙二胺四乙酸（ethylene diaminete traacetic acid，EDTA）和抗壞血酸），在氮氣保護下室溫振蕩水解4 h。待水解完畢，用HCl溶液將pH值調節至1～2，真空抽濾，濾液經乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯相，旋轉蒸發除去乙酸乙酯，剩余殘留物冷凍干燥，得到不溶性細胞壁結合酚（insoluble cell wall bound phenolics，ICP）提取物。

1.3.2 硬毛地筍提取物酚含量的測定

提取物酚含量采用福林-酚法測定[28-29]，得到沒食子酸標準曲線方程為y＝0.096 5x+0.097 4（0～6.4 μg/mL），相關系數R＝0.991 7。樣品中酚含量以每毫克提取物中沒食子酸質量表示（μg/mg）。

1.3.3 硬毛地筍酚類化合物HPLC分析

采用HPLC法對硬毛地筍FP和ICP提取物的組成進行分析，條件如下：ZORBAX SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流速1 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量10 μL；檢測波長為320 nm。流動相A為體積分數100%甲醇，流動相B為甲醇-冰乙酸-超純水溶液（體積比為1∶10∶89）。梯度洗脫程序如下：FP提取物：0～1 min：15%流動相A；1～16 min：15%～25%流動相A；16～18 min：25%流動相A；18～30 min：25%～30%流動相A；30～35 min：30%～40%流動相A；35～40 min：40%～20%流動相A；40～43 min：20%～15%流動相A；ICP提取物：0～1 min：20%流動相A；1～16 min：20%～38%流動相A；16～18 min：38%流動相A；18～30 min：38%～60%流動相A；30～35 min：60%流動相A；35～40 min：60%～20%流動相A；40～43 min：20%流動相A。

以迷迭香酸和咖啡酸標準品制作回歸曲線，得到回歸方程如下：FP提取物：y＝20.75x-335.16（R＝0.998 5，40～200 μg/mL）和y＝65.704x-989.22（R＝0.992 5，40～200 μg/mL）；ICP提取物：y＝14.186x-54.828（R＝0.991 4，5～40 μg/mL）和y＝53.679x-166.8（R＝0.993 4，5～40 μg/mL）。

1.3.4 硬毛地筍酚類化合物對ROO·介導的DNA損傷保護作用的測定

參考Spanou等[30]的方法略作修改。將FP和ICP提取物分別配制成質量濃度為2、4、6、8、10 mg/mL的待測液，反應液共20 μL，包括1 μL 0.5 μg/L pBR322質粒DNA、11 μL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（10 mmol/L，pH 7.4）、5 μL待測液和3 μL AAPH溶液（50 mmol/L，PBS溶解）充分混勻，置于37 ℃水浴鍋中避光反應45 min。待反應結束后，取出4 μL反應液并加入2 μL loading buffer（質量分數0.15%溴酚藍溶液、10 mmol/L EDTA和質量分數40%蔗糖溶液），混勻后吸取4 μL置于質量分數1.0%瓊脂糖凝膠（含0.5 μg/mL溴化乙錠）中，于Tris/乙酸/EDTA緩沖液中電泳50 min。待電泳結束，用凝膠成像系統進行半定量分析。空白對照用PBS代替提取液，正常對照用PBS代替提取液和AAPH溶液，用人工合成抗氧化劑Trolox作為陽性對照組。按下式計算雙螺旋比例。

式中：A1為雙螺旋DNA的灰度值；A2為開環型DNA的灰度值；A3為線性DNA的灰度值。

1.4 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 硬毛地筍酚類化合物提取物的酚含量

表1 硬毛地筍酚類化合物提取物的酚含量Table1 Phenolic contents of L. lucidus Turcz. on different dates μg/mg

從表1可以看出，采收期對硬毛地筍酚類化合物提取物酚含量的影響具有顯著性。FP提取物的酚含量在T1和T2采收期之間無顯著性差異，在T3采收期時顯著下降；而ICP提取物隨著采收期的延后其酚含量呈現先降低后升高的趨勢。

2.2 硬毛地筍酚類化合物組成的分析

圖1 標準品及FP和ICP提取物的HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms of phenolic standards, FP and ICP

表2 硬毛地筍酚類化合物提取物中迷迭香酸和咖啡酸的含量Table2 Contents of rosmarinic acid and caffeic acid in phenolic extracts from L. lucidus Turcz.μg/mg

從圖1可以看出，硬毛地筍ICP提取物中分離出的色譜峰多于FP提取物。表2結果表明，不同的酚類化合物在硬毛地筍FP和ICP提取物中的質量濃度具有明顯差異。在FP提取物中，迷迭香酸是主要的酚類化合物，而咖啡酸質量濃度較低甚至未檢出；相反地，在ICP提取物中，咖啡酸是主要的酚類化合物，而迷迭香酸質量濃度較低。這可能是因為在ICP提取過程中使用NaOH水解，使咖啡酸苷類化合物在堿性條件下水解，從而導致咖啡酸質量濃度升高。此外，采收期對迷迭香酸和咖啡酸在FP和ICP提取物中質量濃度的影響不同。在FP提取物中，迷迭香酸的質量濃度在T1和T2采收期之間無顯著性差異，從T2到T3采收期下降了37%，這與其酚含量的變化趨勢基本一致；在ICP提取物中，這兩種化合物的質量濃度隨著采收期的延后均呈現先上升后下降的變化趨勢，這與酚含量的變化趨勢相反，表明其他未鑒定出的酚類物質對總酚含量的變化也具有顯著的貢獻。

2.3 硬毛地筍酚類化合物提取物對ROO·介導的DNA損傷的保護作用

硬毛地筍酚類化合物對ROO·介導的DNA損傷的保護作用以DNA雙螺旋比例進行表征，雙螺旋比例越高，表明其對DNA損傷的保護作用越強。由圖2可以看出，正常pBR322質粒DNA以雙螺旋結構為主，被ROO·損傷后，雙螺旋DNA轉變成了開環型甚至是線型結構，當添加硬毛地筍酚類化合物提取物和Trolox后，未觀察到雙鏈斷裂后的線性DNA分子，表明硬毛地筍酚類化合物提取物和Trolox可以阻止ROO·介導的DNA雙鏈的斷裂。

圖2 硬毛地筍酚類化合物和Trolox對ROO·介導的DNA損傷的保護作用Fig.2 Protective effects of phenolic compounds from L. lucidus Turcz.and Trolox on ROO·-mediated DNA damage

硬毛地筍FP和ICP提取物對DNA損傷的保護作用不同。就FP提取物而言：在2～10 mg/mL質量濃度范圍內，T1采收期的雙螺旋比例在87.52%～89.52%范圍內，且隨FP提取物質量濃度的增加，保護作用無顯著性變化（P＞0.05）；T2采收期雙螺旋比例在64.57%～90.32%范圍內，當FP提取物質量濃度由2 mg/mL增加至4 mg/mL時，保護作用顯著升高（P＜0.05），但在4～10 mg/mL質量濃度范圍內時，保護作用隨質量濃度的增加而顯著降低（P＜0.05）；T3采收期雙螺旋比例在65.71%～92.35%范圍內，2～8 mg/mL質量濃度范圍內保護作用無顯著差異（P＞0.05），當質量濃度由8 mg/mL上升至10 mg/mL時，保護作用顯著下降（P＜0.05）。就ICP提取物而言：在2～10 mg/mL質量濃度范圍內，T1采收期的雙螺旋比例在4.4%～71.9%范圍內，當質量濃度由2 mg/mL增加至4 mg/mL時，保護作用顯著下降（P＜0.05），但4～10 mg/mL范圍內保護作用隨著質量濃度增加而顯著上升（P＜0.05）；T2采收期雙螺旋比例在3.09%～75.49%之間，保護作用隨著質量濃度的增加而顯著升高（P＜0.05）；T3采收期雙螺旋比例在2.25%～65.94%之間，在2～6 mg/mL質量濃度范圍內保護作用無顯著性差異（P＞0.05），當質量濃度由6 mg/mL上升至10 mg/mL時，保護作用隨著質量濃度的增加而顯著上升（P＜0.05）。

Trolox對ROO·介導的DNA損傷具有顯著的保護作用，在25～400 μg/mL質量濃度范圍內，Trolox的雙螺旋比例在30.46%～92.28%之間，當質量濃度在25～200 μg/mL范圍內時，保護作用隨著質量濃度的增加而顯著上升（P＜0.05）；進一步增加質量濃度，保護作用未顯著上升（P＞0.05）。與Trolox相比，2～10 mg/mL范圍內的FP提取物最大保護作用接近于200～400 μg/mL范圍內Trolox的最大保護作用，而ICP提取物在測定質量濃度范圍內的最大保護作用小于Trolox。可以看出，FP提取物對DNA損傷的保護作用顯著強于ICP提取物，這與其酚類化合物組成不同有關。

2.4 相關性分析

表3 提取物酚含量與DNA損傷保護作用的相關性分析Table3 Correlational analysis between phenolic contents and protective effects on DNA damage

由表3可以看出，T2和T3采收期的ICP提取物酚含量與保護ROO·介導的DNA損傷的作用具有顯著的正相關性，說明提取物中的酚類物質對DNA損傷的保護作用具有顯著的貢獻；而其他提取物中的酚含量與保護DNA損傷的作用沒有顯著的正相關性，甚至出現負相關，說明其保護作用不僅與酚含量有關，還與酚類化合物的組成有關。硬毛地筍酚類化合物可能通過其主要成分，也可能通過其各成分之間的協同作用發揮保護DNA損傷的作用。

3 結 論

不同采收期對硬毛地筍酚類化合物提取物酚含量的影響具有顯著差異。硬毛地筍酚類化合物提取物中共鑒定出2 種化合物，分別為咖啡酸和迷迭香酸，不同化合物在FP和ICP提取物中的質量濃度具有明顯差異。硬毛地筍酚類化合物對ROO·介導的DNA損傷具有顯著的保護作用，但不同組分酚類化合物的保護作用存在差異，其中FP提取物對DNA損傷的保護作用明顯強于ICP提取物。