N-羥乙酰神經(jīng)氨酸分子的結(jié)構(gòu)性質(zhì)

常 瑞，梁美蓮，周櫻子，李洪英，徐阿奇，晏印雪，劉春麗，曾雪峰，朱秋勁*

（貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州省農(nóng)畜產(chǎn)品貯藏與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025）

唾液酸是含9 個(gè)碳原子并具有吡喃糖結(jié)構(gòu)的酸性氨基糖，系統(tǒng)命名為5-氨基-3,5-二脫氧-D-甘油-D-半乳糖壬酮糖。N-羥乙酰神經(jīng)氨酸（N-glycolylneuraminic acid，Neu5Gc）是其中重要的一種，其余兩種分別是3-脫氧-D-甘油-D-半乳壬酮糖（3-deoxy-D-glycerol-D-galactone ketone，KDN）和N-乙酰神經(jīng)氨酸（N-acetylneuraminic acid，Neu5Ac）[1]。由于人類(lèi)進(jìn)化過(guò)程中編碼表達(dá)胞苷單磷酸N-乙酰神經(jīng)氨酸羥化酶的基因發(fā)生了突變，因此人體不能合成Neu5Gc[2]。正常人體中存在的唾液酸只有Neu5Ac，母乳中質(zhì)量濃度約為0.3～1.5 mg/mL，其是促進(jìn)人腦發(fā)育的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[3]。Neu5Gc在紅肉等加工肉制品中有微量存在[4]，流行病學(xué)研究表明飲食攝入的Neu5Gc和炎癥的產(chǎn)生有一定聯(lián)系[5]。2015年國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)基于結(jié)/直腸癌的流行病學(xué)結(jié)果，將加工肉制品列為I類(lèi)致癌食品[6]。

分子的結(jié)構(gòu)參數(shù)與其物理化學(xué)反應(yīng)活性有密切的關(guān)系，量子化學(xué)計(jì)算是研究分子結(jié)構(gòu)參數(shù)的有力工具。Djeradi等通過(guò)對(duì)黃酮化合物福井描述符的計(jì)算，構(gòu)建了可預(yù)測(cè)抗氧化活性的定量構(gòu)效關(guān)系模型，模型和實(shí)驗(yàn)值的相關(guān)系數(shù)達(dá)0.815 9[7]。不同加工方法在可一定程度上降低食品中Neu5Gc水平[8]。已報(bào)道的有物理法（高溫油炸、蒸煮）、生物化學(xué)法（發(fā)酵、酶制劑）等，這些方法降低效果并不理想。食品加工過(guò)程中的溶劑對(duì)食品組分有一定程度影響[9]，考察加工過(guò)程常用的脂溶性溶劑和有機(jī)酸類(lèi)對(duì)Neu5Gc等食品危害因子的反應(yīng)活性可為提高其解離效果提供一定參考。

目前關(guān)于唾液酸分子結(jié)構(gòu)的理論研究主要集中在Neu5Ac不同構(gòu)象。Veluraja等用半經(jīng)驗(yàn)算法研究了唾液酸化的低聚糖的優(yōu)勢(shì)構(gòu)象及其與唾液酸酶的結(jié)合[10]。Sawada等在B3LYP/6-31G(d,p)理論水平討論了Neu5Ac的最佳構(gòu)象和水分子相互作用時(shí)的分子間氫鍵[11]。van Lenthe等采用HF/6-31G(d)理論水平研究了6 種唾液酸衍生物的電荷、軌道信息以及與唾液酸相關(guān)的酶類(lèi)[12]。Priyadarzini等研究了Neu5Ac在生物環(huán)境中的三維構(gòu)象和分子間氫鍵作用[13]。但關(guān)于Neu5Gc的分子結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)性質(zhì)尚鮮有研究。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)量子化學(xué)密度泛函理論研究Neu5Gc分子電子結(jié)構(gòu)、不同溶劑環(huán)境下分子反應(yīng)活性和相關(guān)物理化學(xué)性質(zhì)，以期為研究其食品加工環(huán)境下的反應(yīng)活性和有效解離提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 Neu5Gc分子電子結(jié)構(gòu)分析

Neu5Gc的分子結(jié)構(gòu)取自PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)，在M062X/6-31+G(d,p)水平上完成了對(duì)Neu5Gc分子的幾何構(gòu)型優(yōu)化和頻率振動(dòng)分析，得到能量極小的無(wú)虛頻結(jié)構(gòu)。在優(yōu)化后的結(jié)構(gòu)上利用Multiwfn3.5程序進(jìn)行分子表面靜電勢(shì)、前線(xiàn)分子軌道、自然電荷分布、概念密度泛函活性指數(shù)的計(jì)算。

概念密度泛函是密度泛函理論的化學(xué)活性理論，包括全局描述符（電負(fù)性Χ、化學(xué)勢(shì)μ、化學(xué)硬度η、化學(xué)軟度S、親電指數(shù)ω）和局部描述符（福井函數(shù)等）。分子軌道的分布在一定程度上可以反映分子的反應(yīng)活性。硬軟酸堿理論（hard-soft-acid-base，HSAB）認(rèn)為，缺乏電子的親電試劑可以看作路易斯酸，富電子的底物可以看作路易斯堿，較硬（軟）的路易斯酸容易與較硬（軟）的路易斯堿相互作用。Parr等證明了用密度泛函計(jì)算分子化學(xué)勢(shì)時(shí)與元素的電負(fù)性等同[14]。全局描述符可由前線(xiàn)分子軌道分布近似得到，計(jì)算公式如式（1）～（5）[15]。

式中：ELUMO為最高低據(jù)軌道能級(jí)；EHOMO為最高占據(jù)軌道能級(jí)。

福井函數(shù)可反映體系電子數(shù)變化時(shí)各個(gè)位置上電子密度的變化程度，是重要的局部活性描述符。福井函數(shù)越大的位點(diǎn)，其相應(yīng)的反應(yīng)活性也越大。在軌道弛豫效應(yīng)不顯著的情況下，前線(xiàn)軌道理論是對(duì)福井函數(shù)的一個(gè)合理的近似，可由公式（6）～（8）計(jì)算[16]。

式中：ρN（r）、ρN+1（r）、ρN-1（r）分別表示體系在初始態(tài)、電離掉一個(gè)電子和結(jié)合一個(gè)電子的狀態(tài)時(shí)的電子密度；ρHOMO（r）、ρLUMO（r）分別為分子最高占據(jù)軌道和最低非占據(jù)軌道的電子密度。

將福井函數(shù)收縮到原子上就得到簡(jiǎn)縮型福井函數(shù)（condensed Fukui function，CFF），可實(shí)現(xiàn)對(duì)原子電荷進(jìn)行定量分析。此處用qA表示分子中原子A的Hirshfeld電荷，計(jì)算表達(dá)式如式（9）～（11）[17]。

根據(jù)Neu5Gc分子結(jié)構(gòu)含多個(gè)羥基的特點(diǎn)，為分析其分子內(nèi)弱相互作用，在M062X-D3/6-311+G(d,p)水平氣相條件下優(yōu)化結(jié)構(gòu)并產(chǎn)生波函數(shù)文件。根據(jù)Johnson等[18]提出的約化密度梯度函數(shù)（reduced-density gradient，RDG）理論，進(jìn)行約化密度梯度函數(shù)等值面分析；為表征弱相互作用的關(guān)鍵臨界點(diǎn)，根據(jù)分子中原子（atom in molecular，AIM）理論進(jìn)行電子密度拓?fù)浞治鯷19]。

1.2 Neu5Gc化學(xué)常數(shù)的計(jì)算

通過(guò)對(duì)有機(jī)反應(yīng)過(guò)程定量計(jì)算，可以得到一些關(guān)鍵物理化學(xué)參數(shù)。在M062X/6-31+G(d,p)水平氣相優(yōu)化后的基礎(chǔ)上，采用相應(yīng)的理論基組水平計(jì)算Neu5Gc的解離常數(shù)、分配系數(shù)、鍵解離能。

1.2.1 Neu5Gc解離常數(shù)的計(jì)算

化合物的酸堿解離常數(shù)pKa值是重要的分子參數(shù)之一。Neu5Gc分子含一個(gè)羧基基團(tuán)，在水溶液中可以發(fā)生解離呈現(xiàn)酸性。已知Neu5Ac的解離常數(shù)pKa為2.6。且羧酸化合物（HA）在水溶液存在以下熱力學(xué)循環(huán)方程[20]。

式中：△G(aq)為水溶液下質(zhì)子解離過(guò)程的自由能；△G(g)為氣相下質(zhì)子解離過(guò)程自由能；△Gsolve為溶解自由能。

張霞[21]提出了利用氣相條件下相對(duì)吉布斯自由能差法計(jì)算pKa值的簡(jiǎn)便算法。Neu5Gc、Neu5Ac及其陰離子在氣相條件下的吉布斯自由能以熱力學(xué)高精度組合算法CBS-QB3進(jìn)行。其中，△G（HA）是中性和陰離子態(tài)下相對(duì)吉布斯自由能差，其提出的計(jì)算表達(dá)式如式（15）所示。

1.2.2 Neu5Gc分配系數(shù)的計(jì)算

有機(jī)物在正辛醇-水中的分配系數(shù)lg Poct/wat可以表示其對(duì)水相和醇相體系的親和性差異，可以一定程度上模擬體內(nèi)細(xì)胞膜和細(xì)胞溶質(zhì)的環(huán)境。Ho等[22]認(rèn)為，隱式溶劑模型下，溶解自由能為溶劑模型下單點(diǎn)能和氣相條件下單點(diǎn)能的差值。根據(jù)Bannan等[23]提出的公式，正辛醇-水兩相體系下分配系數(shù)的計(jì)算如式（16）、（17）所示。

式中：E辛醇和E水分別代表化合物在相應(yīng)溶劑下的單點(diǎn)能。隱式溶劑模型不同于顯示溶劑模型，它將溶劑環(huán)境認(rèn)為是連續(xù)而非離散的狀態(tài)，更加趨近于真實(shí)體系，故采用SMD（solvation model density）隱式溶劑模型計(jì)算，計(jì)算水平為M05-2X/6-31G(d)。根據(jù)Neu5Gc結(jié)構(gòu)相似性，選擇已知油水分配系數(shù)的β-D-葡萄糖進(jìn)行對(duì)比計(jì)算。

1.2.3 Neu5Gc不同羥基位點(diǎn)的脫氫解離能

鍵解離能（bond dissociation energy，BDE）是破壞某一化學(xué)鍵所需要的能量。常用于表征黃酮類(lèi)、多酚類(lèi)的抗氧化性，Neu5Gc是吡喃糖衍生物，根據(jù)糖類(lèi)化合物的羥基和清除自由基活性有一定相關(guān)性[24]，Neu5Gc不同部位羥基的脫氫解離能計(jì)算公式如式（18）所示[25]。

式中：H（MO·）代表脫氫后的自由基片段的焓值；H（MOH）代表母體分子焓值。

溶劑化效應(yīng)是指溶劑與溶質(zhì)發(fā)生作用時(shí)會(huì)在溶質(zhì)周?chē)纬珊穸炔煌娜軇ぁ＝殡姵?shù)常用于反映溶劑的極性，溶劑溶解度參數(shù)和極性對(duì)分子構(gòu)型和電荷分布有一定影響。為考慮不同溶劑對(duì)解離能的影響，選取不同介電常數(shù)的溶劑（苯ε＝2.27、四氯化碳ε＝2.24、乙酸ε＝6.25、乙醇ε＝24.85、乳酸ε＝22.00、甲酸ε＝51.10、水ε＝78.35）在SMD溶劑模型下進(jìn)行計(jì)算。其中，溶劑乳酸根據(jù)Gaussian 16手冊(cè)進(jìn)行自定義溶劑參數(shù)擬合。優(yōu)化水平為M062X/6-31+G(d,p)，單點(diǎn)能在def2TZVP基組下進(jìn)行。計(jì)算熱力學(xué)校正量時(shí)，采用零點(diǎn)能校正因子0.967。

1.3 Neu5Gc紅外和紫外光譜的模擬

在M062X/6-31+G(d,p)水平氣相優(yōu)化的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進(jìn)行理論紅外光譜模擬。采用的頻率校正因子為0.94。為比較不同溶劑條件下Neu5Gc的理論紫外光譜，根據(jù)含時(shí)密度泛函理論在PBE1PBE/6-311G(d)水平下優(yōu)化結(jié)構(gòu)，TZVP基組下擬合光譜[26]。本實(shí)驗(yàn)中所有的量子化學(xué)計(jì)算部分在貴州大學(xué)云計(jì)算平臺(tái)Gaussian 16軟件包上完成，波函數(shù)分析部分采用開(kāi)源的Multiwfn 3.5程序完成[27]。

2 結(jié)果與分析

2.1 Neu5Gc分子電子結(jié)構(gòu)

在Gaussian 16程序中搭建好Neu5Gc的分子結(jié)構(gòu)模型。M062X/6-31+G(d,p)水平下同時(shí)進(jìn)行幾何構(gòu)型優(yōu)化和振動(dòng)分析，得到無(wú)虛頻的能量極小結(jié)構(gòu)（圖1A）。對(duì)幾何構(gòu)型優(yōu)化產(chǎn)生的波函數(shù)文件進(jìn)行Multiwfn 3.5程序分析，得到能夠描述電荷分布和靜電相互作用的分子表面靜電勢(shì)分布圖（圖1B）。以氣相條件下為例，Neu5Gc最高占據(jù)軌道能級(jí)（EHOMO）和最低空軌道能級(jí)（ELUMO）分布如圖2所示。Neu5Gc在不同溶劑下的EHOMO、ELUMO及全局活性指數(shù)如表1所示。Neu5Gc不同羥基氧原子上的簡(jiǎn)縮型福井函數(shù)值如表2所示。

圖1 Neu5Gc優(yōu)化后構(gòu)型及分子表面靜電勢(shì)分布Fig.1 Optimized geometry and electrostatic potential of Neu5Gc

從圖1A可看出，優(yōu)化后的Neu5Gc分子吡喃環(huán)上的取代基團(tuán)均處于能量較低的平伏鍵位置，這表明優(yōu)化過(guò)程是合理的。分子表面靜電圖上顏色深淺反映靜電勢(shì)的強(qiáng)弱，正的靜電勢(shì)區(qū)域用紅色表示，負(fù)的區(qū)域用藍(lán)色表示。由圖1B可看出，靜電勢(shì)在負(fù)相區(qū)域的極小值為-182.34 kJ/mol，位于O2位附近，其次為O10位附近（-180.66 kJ/mol），表明這些區(qū)域負(fù)電荷集中，親電活性較高。靜電勢(shì)在正相區(qū)域的極大值是253.66 kJ/mol，位于羧基基團(tuán)O6附近，其次為C14位附近（214.73 kJ/mol）、C15位附近（216.41 kJ/mol），表明這些區(qū)域正電荷集中，親核性較高。Garzón等對(duì)香豆酸與自由基攻擊位點(diǎn)的研究也表明，羥基和羧基易受到較高親核能力的自由基攻擊[28]。唾液酸家族的燕窩酸作為糖類(lèi)衍生物[29]，其抗氧化活性可能也和其羥基、羧基有一定關(guān)聯(lián)。

圖 2 Neu5Gc HOMO和LUMO軌道分布圖Fig.2 HOMO and LUMO orbital map of Neu5Gc molecules

根據(jù)前線(xiàn)分子軌道理論，EHOMO表征分子給電子的能力，EHOMO越大，給電子能力越強(qiáng)。ELUMO表征分子吸電子的能力，ELUMO越小，吸電子能力越強(qiáng)。前線(xiàn)分子軌道能級(jí)差△E能壘值越小，則表征分子中電子越容易發(fā)生躍遷，反應(yīng)活性就越強(qiáng)[30]。用紅色和綠色分別代表軌道的正負(fù)相位，結(jié)合圖1A、2A可以看出，Neu5Gc的HOMO軌道主要分布在酰胺基團(tuán)（N11—C21＝O9）及其附近，表明該區(qū)域易受到親電試劑攻擊。從圖2B可以看出，LUMO軌道主要分布在羧基基團(tuán)（O6—C19＝O8）處，表明易受到親核試劑攻擊，這和分子表面靜電勢(shì)的分析是一致的。Zhao Gang等對(duì)膠原蛋白氨基酸的軌道分析也顯示出HOMO軌道主要集中在氨基區(qū)域，LUMO軌道主要集中在羧基區(qū)域[31]。

表1 不同溶劑下Neu5Gc全局活性參數(shù)M062X/6-31G(d,p)Table1 Neu5Gc global activity parameters at M062X/6-31G(d,p) level in different solvent environments

從表1可以看出，EHOMO最大的是乙醇條件下（-8.485 2 eV），最小的是氣相條件下（-8.670 6 eV）。表明在乙醇條件下，Neu5Gc比較容易失去電子，還原性強(qiáng)。ELUMO最大的是乳酸條件下（1.331 2 eV），氣相條件下則最小（0.971 3 eV），這表明乳酸條件下Neu5Gc吸電子能力較弱。軌道能級(jí)差氣相條件下最小（9.642 0 eV），在乳酸條件下最大（9.824 8 eV），表明其在氣相條件下不穩(wěn)定。

由表1可知，Neu5Gc在氣相條件下具有最低的化學(xué)硬度，最高的化學(xué)軟度；乳酸條件下則有最高的化學(xué)硬度，最低的化學(xué)軟度。乙酸和甲酸下的化學(xué)硬度也較氣相條件下強(qiáng)。表明Neu5Gc可作為較硬的路易斯堿，易于和乳酸等路易斯酸發(fā)生反應(yīng)。Chen Yue等對(duì)食品中Neu5Gc含量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，酸奶、奶酪等發(fā)酵乳制品中的含量明顯低于其他動(dòng)物性食品[32]。從表1中還可看出，乳酸條件下Neu5Gc的電負(fù)性最低，親電指數(shù)最小，化學(xué)勢(shì)最高，這表明乳酸不僅可以提高食品抗氧化性[33]，還可以與黃曲霉毒素等危害因子進(jìn)行相互作用達(dá)到降解的效果[34]。

表2 Neu5Gc氮氧原子簡(jiǎn)縮型福井函數(shù)值Table2 Neu5Gc nitrogen oxygen atom condensed Fukui function values

簡(jiǎn)縮型福井函數(shù)能夠?qū)Ψ肿又械脑佣糠治銎溆H電親核反應(yīng)活性，f-表征親電活性，f+表征親核活性[35]。已知氮氧原子的電負(fù)性大于碳原子，故此處分析Neu5Gc的氮氧原子。從表2可以看出，在以上8 種條件下，Neu5Gc中氮原子的f-值均大于氧原子的值，且在水相下最大。f-值最低為氣相條件下O5位，最大為水相條件下O8位，O2、O9、O10位數(shù)值也略高于其他氧原子，這和HOMO對(duì)親電位點(diǎn)的分析是一致的。羧基部位O4、O6、O8位的f+值總體大于其他氧原子，且f+值最大為甲酸條件下O8位，這和LUMO親核活性分析結(jié)論一致。

分子體系內(nèi)的相互作用范圍可以是在原子核附近、化學(xué)鍵附近、弱相互區(qū)域、分子邊緣。約化密度梯度函數(shù)基于電子密度，能夠?qū)植康姆枪矁r(jià)相互作用進(jìn)行定義。AIM理論的電子密度拓?fù)浞治隹梢燥@示電子密度梯度為零的鍵臨界點(diǎn)，臨界點(diǎn)處的電子密度和鍵的強(qiáng)度有關(guān)[36]。Neu5Gc分子內(nèi)弱相互作用RDG等值面和AIM電子密度拓?fù)浞治鼋Y(jié)果如圖3所示。圖3A中藍(lán)色部分主要是強(qiáng)的吸引作用，如氫鍵和鹵鍵等；綠色的部分主要是范德華力，偏紅色的部分主要為較強(qiáng)的斥力作用，如空間位阻效應(yīng)。圖3B中藍(lán)色的點(diǎn)表示鍵臨界點(diǎn)，紅色表示環(huán)臨界點(diǎn)。從圖3A可看出，Neu5Gc分子吡喃環(huán)內(nèi)和羥基氧上主要是位阻效應(yīng)和弱的范德華力，乙酰基團(tuán)和鄰近羥基產(chǎn)生了一定的位阻效應(yīng)。受乙酰基氮原子、鄰近羥基氧原子電負(fù)性影響，氮原子上氫原子和O5產(chǎn)生了氫鍵作用。由圖3B可看出，電子密度拓?fù)浞治龅慕Y(jié)果和RDG分析一致，鍵臨界點(diǎn)分布在RDG等值面上的強(qiáng)靜電吸引力處，環(huán)臨界點(diǎn)分布在空間位阻處。通過(guò)對(duì)鍵臨界點(diǎn)連接的原子的距離分析發(fā)現(xiàn)，其均在氫鍵形成的鍵長(zhǎng)范圍內(nèi)。綜上分析，可得出Neu5Gc分子內(nèi)形成的氫鍵分布在O5—H30、O9—H31、O1—H34處，相應(yīng)的距離為1.98、1.86、1.90 ?。由于Neu5Gc分子內(nèi)可形成3 個(gè)較強(qiáng)的氫鍵，這可能是導(dǎo)致其在食品熱加工過(guò)程中穩(wěn)定不易解離的原因。梁美蓮等用高溫蒸煮和油炸處理牛肉，發(fā)現(xiàn)其中Neu5Gc含量并沒(méi)有明顯降低[37]。

圖3 Neu5Gc RDG等值面與電子密度拓?fù)浞植糉ig.3 RDG isosurface and electron density topological distribution of Neu5Gc

自然電荷分布是表征分子內(nèi)不同原子上所帶電荷大小的參數(shù)。電荷的分布也可以反映分子體系的親電、親核活性，負(fù)電荷越集中的區(qū)域其親電活性也強(qiáng)[38]。計(jì)算得到的Neu5Gc氮氧原子的自然電荷分布如表3所示，氣相條件下O5位電荷最小，O7位次之；溶液條件下，電荷大小為結(jié)果O7位＜O5位、O9位＜O8位，表明親電活性O(shè)7位＞O5位、O9位＞O8位，這和f-值是一致的。O6位和N11在氣相條件下電荷最小，其余氧原子在甲酸條件下電荷最小，乙酰基（氧原子O9）和羧基氧（原子O8）則在氣相條件下電荷最大，表明親電活性隨溶劑有一定差異性。對(duì)羥基氧原子O3、O4、O5、O7、O10位，不同溶劑下電荷滿(mǎn)足四氯化碳＜苯＜水相＜乙醇，表明其在非極性溶劑下易發(fā)生親電反應(yīng)；不同有機(jī)酸下電荷大小滿(mǎn)足甲酸＜乳酸，且二者電荷小于氣相，表明酸性條件下Neu5Gc分子活性較氣相條件下增強(qiáng)。

表3 Neu5Gc氮氧原子自然電荷分布Table3 Natural charge distribution of nitrogen and oxygen atoms of Neu5Gc

2.2 Neu5Gc化學(xué)常數(shù)的計(jì)算

2.2.1 解離常數(shù)、分配系數(shù)的計(jì)算

解離常數(shù)和油水分配系數(shù)與食品的風(fēng)味釋放、包材遷移、生物利用度、代謝轉(zhuǎn)化等有關(guān)。Neu5Ac和Neu5Gc水溶液中的pKa值計(jì)算結(jié)果如表4所示。對(duì)Neu5Ac、Neu5Gc和β-D-葡萄糖在正辛醇和水相下的單點(diǎn)能進(jìn)行分配系數(shù)計(jì)算，結(jié)果如表4所示。計(jì)算得到Neu5Ac的pKa為2.20，與已知的實(shí)驗(yàn)值2.60相比，絕對(duì)誤差為0.4，由此計(jì)算得到Neu5Gc的pKa值為1.84。對(duì)唾液酸母核結(jié)構(gòu)類(lèi)似物β-D-葡萄糖的分配系數(shù)計(jì)算值為-3.70，與已知的實(shí)驗(yàn)值相比，絕對(duì)誤差為0.46。計(jì)算得到Neu5Gc的lg Poct/wat為-3.85，表明其具有良好的親水性，其比Neu5Ac的-3.41稍低，這可能是由于Neu5Gc是Neu5Ac乙酰基羥化的產(chǎn)物。

表4 Neu5Gc的理論pKa、lg P值Table4 Theoretical pKa and lg P values of Neu5Gc

2.2.2 Neu5Gc不同部位脫氫解離能比較

鍵解離能值越小表示化學(xué)鍵越容易斷裂或形成，反應(yīng)越容易發(fā)生。抗氧化劑清除自由基作用機(jī)制之一是氫原子轉(zhuǎn)移機(jī)制。醇類(lèi)如甲醇、正丁醇常作為有效的自由基淬滅劑，Neu5Gc含多個(gè)醇羥基，不同部位的脫氫活性因原子電荷分布、溶劑介電常數(shù)等不同會(huì)有所差異。結(jié)合食品加工溶劑環(huán)境，選取非極性溶劑和有機(jī)酸考察Neu5Gc脫氫解離能，結(jié)果如表5所示。

表5 Neu5Gc 不同羥基部位O—H解離能（M062X/def2TZVP）Table5 O—H dissociation energy for different hydroxyl sites of Neu5Gc (M062X/def2TZVP)

從表5可以看出，不同部位解離能有較大差異。除水相外，O7位脫氫解離能最小，氣相條件下達(dá)到最低（427.908 9 kJ/mol），乳酸條件下次之（433.413 0 kJ/mol）；苯條件下O10位具有最大的解離能（464.061 4 kJ/mol），O3位次之（458.618 2 kJ/mol）；這和O7位負(fù)電荷集中、親電性較強(qiáng)是一致的。解離能在氣相、四氯化碳、乙酸、乳酸、甲酸條件下呈現(xiàn)出O3位＞O2位＞O7位的順序。在水相、乙醇、苯相中則呈現(xiàn)出O3位＞O5位＞O4位＞O2位的順序。3 種有機(jī)酸中，乳酸條件下羥基脫氫解離焓均小于其余兩種有機(jī)酸，表明羥基在乳酸條件下易于發(fā)生脫氫，這和乳酸條件下Neu5Gc的LUMO軌道值最大是一致的。參考幾種抗氧化劑已知的最小脫氫解離能：沒(méi)食子酸為329.69 kJ/mol、白藜蘆醇為345.18 kJ/mol、槲皮素為369.86 kJ/mol，對(duì)比發(fā)現(xiàn)Neu5Gc具有一定的清除自由基能力[41]。這可能是Neu5Ac可降低脂質(zhì)氫過(guò)氧化物細(xì)胞毒性的原因之一[42]。

2.3 Neu5Gc理論紅外和紫外光譜的模擬

圖4 Neu5Gc的理論紅外光譜圖Fig.4 Theoretical infrared spectrum of Neu5Gc

分子中的基團(tuán)由于發(fā)生伸縮振動(dòng)、變形振動(dòng)等產(chǎn)生的紅外譜圖可以定性描述分子結(jié)構(gòu)。在Neu5Gc優(yōu)化后結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進(jìn)行振動(dòng)分析，得到Neu5Gc的氣相條件下理論紅外光譜如圖4所示。

通常非線(xiàn)性分子的振動(dòng)模式為3N-6（N為原子數(shù)）[43]，Neu5Gc含有117 種振動(dòng)模式。通過(guò)對(duì)振動(dòng)模式的勢(shì)能分布分析，發(fā)現(xiàn)伸縮振動(dòng)模式有40 種，面內(nèi)彎曲振動(dòng)模式有39 種，扭轉(zhuǎn)振動(dòng)模式有26 種，面外彎曲振動(dòng)11 種。結(jié)合Multiwfn 3.5程序分析結(jié)果對(duì)光譜進(jìn)行基團(tuán)指認(rèn)，圖4從左往右依次可以看出尖峰（3 690.563 5、3 649.216 4、3 603.868 0、3 585.195 1、3 494.498 2 cm-1）和前后的幾個(gè)小峰主要是Neu5Gc中羥基的O—H伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的。第2個(gè)尖峰（3302.4341 cm-1處）是乙酰基團(tuán)的N—H收縮振動(dòng)。接著是2 864.955 0 cm-1處的尖峰、2 852.951 0 cm-1處的小峰，這分別是環(huán)上和丙醇支鏈C—H的伸縮振動(dòng)。1 800.600 2、1 659.219 7、1 524.508 2 cm-1這3 個(gè)尖峰則分別是羧基上的O＝C鍵、乙酰基上的O＝C鍵的收縮振動(dòng)和N—H鍵的擺動(dòng)。1 376.458 8、1 284.428 1 cm-1處的振動(dòng)為亞甲基的擺動(dòng)，1 247.082 4、1 167.055 7 cm-1處為C—H的擺動(dòng)。1 116.372 1、1 079.026 3 cm-1處為環(huán)上羥基的擺動(dòng)和C＝O鍵的收縮振動(dòng)。988.329 4 cm-1附近的連續(xù)小峰為C—H擺動(dòng)。664.221 4、564.188 1、481.493、404.134 7、358.786 3、293.431 1、252.084 0、225.408 5 cm-1處的幾個(gè)較小尖峰是羥基擺動(dòng)。最后的連續(xù)弱峰是環(huán)上取代支鏈的彎曲振動(dòng)[44]。

分子的紫外吸收光譜是分子中成鍵軌道的α、π電子和非鍵軌道的n電子吸收紫外光能量躍遷到反鍵軌道α*、π*、n*上的結(jié)果。Neu5Gc氣相和不同溶劑環(huán)境下的理論紫外光譜結(jié)果如圖5所示，不同溶劑下的最大吸收波長(zhǎng)和摩爾吸光系數(shù)如表6所示。

圖5 Neu5Gc理論紫外光譜圖Fig.5 Theoretical UV spectra of Neu5Gc

表6 Neu5Gc不同溶劑下最大吸收波長(zhǎng)（理論）Table6 Maximum absorption wavelengths of Neu5Gc in different solvent environments (in theory)

從圖5和表6可以看出，Neu5Gc的紫外光譜均分布在遠(yuǎn)紫外光區(qū)。在溶劑條件下的最大吸收波長(zhǎng)比氣相條件下大，即在溶劑環(huán)境下Neu5Gc因溶劑導(dǎo)致電子躍遷狀態(tài)改變，發(fā)生了一定程度的紅移。從圖5還可看出，Neu5Gc在非極性溶劑（苯、四氯化碳、乙醇）條件下稍有差異，而在極性溶劑（甲酸、乳酸、水）下差異不大。理論最大吸收波長(zhǎng)為180.087 8 nm，已報(bào)道的不經(jīng)衍生化處理的實(shí)驗(yàn)最大吸收波長(zhǎng)210、205 nm[45-46]。計(jì)算結(jié)果和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異主要可能是由于液相紫外檢測(cè)所采用的溶劑是混合溶劑、實(shí)際過(guò)程中Neu5Gc可能以混合構(gòu)象形式存在，導(dǎo)致理論最大吸收波長(zhǎng)產(chǎn)生藍(lán)移。

3 結(jié) 論

利用量子化學(xué)理論計(jì)算對(duì)Neu5Gc進(jìn)行了分子電子結(jié)構(gòu)參數(shù)分析，解釋和預(yù)測(cè)了其在不同溶劑下的反應(yīng)活性。根據(jù)理論計(jì)算結(jié)果可知，在食品加工過(guò)程中，極性脂溶性溶劑的加工環(huán)境對(duì)Neu5Gc的反應(yīng)活性影響不大，而有機(jī)酸的加入可以提高Neu5Gc的反應(yīng)活性。分子表面靜電勢(shì)分布表明：O2位附近有負(fù)相區(qū)域極小值，羧基基團(tuán)附近有正相區(qū)域極大值。EHOMO在氣相條件下最小（-8.670 6 eV），ELUMO在乳酸條件下最大（1.331 2 eV）。綜合親電指數(shù)、化學(xué)勢(shì)、電負(fù)性、軟度、硬度得到Neu5Gc易于和乳酸等有機(jī)酸發(fā)生反應(yīng)。簡(jiǎn)縮型福井函數(shù)表明氮原子的f-值均大于氧原子，羧基部位集中了較大的f+值。約化密度梯度函數(shù)和電子密度拓?fù)浞治霭l(fā)現(xiàn)分子內(nèi)氫鍵分布在O5—H30、O9—H31、O1—H34處，相應(yīng)的距離為1.98、1.86、1.90 ?。對(duì)Neu5Gc原子自然電荷分布分析表明，負(fù)電荷集中在O7和O5位，氧原子在甲酸下易發(fā)生親電反應(yīng)。計(jì)算得到Neu5Gc的理論pKa值為1.84，lg Poct/wat為-3.85。羥基脫氫解離能計(jì)算表明，Neu5Gc有微弱的抗氧化性，氣相條件下O7位最低：427.908 9 kJ/mol，乳酸條件下次之，433.413 0 kJ/mol。氣相和四氯化碳、乙酸、乳酸、甲酸這4 種溶劑中解離能呈現(xiàn)出O3位＞O2位＞O7位的順序。模擬的紅外光譜圖進(jìn)行圖譜指認(rèn)后符合Neu5Gc主要官能團(tuán)的振動(dòng)模式，進(jìn)行氣相和溶劑條件下的紫外吸收光譜模擬，得到了理論最大吸收波長(zhǎng)180.087 8 nm。

研究食品中存在的外源性致癌物（抗生素、農(nóng)殘、內(nèi)分泌干擾物等）和內(nèi)源性致癌物（生物毒素、生物胺、Neu5Gc等）的消解與遷移規(guī)律可以精準(zhǔn)提高食品安全性。這些危害因子與生物分子、生物環(huán)境的分子間相互作用關(guān)乎人體健康，在加工過(guò)程與環(huán)境中的反應(yīng)和活性變化關(guān)乎食品品質(zhì)。量子化學(xué)與構(gòu)效關(guān)系等理論計(jì)算已成功應(yīng)用于食品抗氧化劑、食品功能因子、印跡聚合物、改性修飾、毒理學(xué)預(yù)測(cè)等的研究，提高了對(duì)反應(yīng)的預(yù)測(cè)能力和機(jī)制的認(rèn)識(shí)水平，為深入研究食品安全性和功能性提供了新的參考。