23 kDa亞型肝再生增強因子在腎纖維化過程中表達水平檢測及意義研究*

夏 寧，顏如玉，廖曉輝，張 玲△（重慶醫科大學附屬第二醫院：.風濕免疫科；.腎內科，重慶40000）

肝再生增強因子（ALR）是一種能促進肝臟再生、具有熱穩定性和非特異性的生長因子，在肝臟、睪丸及腎臟中均有表達，并能自分泌到細胞外[1]。ALR有3種亞型，其中15 kDa ALR亞型主要存在于核內及胞質內[2-3]，21 kDa及23 kDa ALR亞型則主要定位于線粒體內膜系統，參與鐵（Fe）和硫（S）離子的轉運，維持鐵硫蛋白（Fe/S蛋白）的生物活性及細胞Fe離子內穩態[4-5]。筆者所在課題組既往研究發現ALR在腎小管上皮細胞缺血再灌注損傷過程中具有抗凋亡作用，并且證實ALR通過減輕線粒體氧化應激損傷，發揮保護作用[6-7]。缺氧所造成的線粒體氧化損傷可導致腎小管功能受損，引起大量致纖維化因子的產生，并經多途徑引起腎間質纖維化（RIF）[8]。因此，ALR有可能通過線粒體途徑參與慢性腎小管間質損傷的病理生理過程及RIF進展過程。本實驗擬通過轉化生長因子β1（TGF-β1）誘導的人近端腎小管上皮細胞（HK-2細胞）上皮-間質轉化（EMT）模型及單側輸尿管梗阻術（UUO）大鼠模型，通過分析細胞及組織中內源性ALR表達水平的變化，驗證前述猜想，并為進一步研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料 HK-2細胞購自美國模式培養物集存庫（ATCC），兔抗人ALR多抗體、兔抗大鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體購自德國Santacruz公司，兔抗人鈣黏附蛋白 E（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）單克隆抗體購自英國Abcam，高純度總RNA提取試劑盒購自北京百泰克生物技術有限公司，RNA逆轉錄試劑盒、重組人TGF-β1購自美國R&D Systems公司，實時定量聚合酶鏈反應（PCR）試劑盒、異硫氰酸熒光素（FITC）標記羊抗兔IgG抗體購自中杉金橋公司，PCR擴增上、下游引物由華大基因公司合成。雄性SD大鼠20只，購自重慶醫科大學實驗動物中心，體重250～300 g。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及處理 HK-2細胞以含10%胎牛血清（FBS）的1640培養液37℃、5%CO2條件下貼壁培養，以0.25%胰酶消化，1∶3比例傳代，細胞生長至70%～80%融合時，用無血清培養液同步化24 h，再行分組處理。空白對照組常規培養，不給予任何處理；TGF-β1刺激組（包括 TGF-β1處理終濃度 5、10、15 ng/mL 3個亞組）。培養12 h后收集細胞，用于ALR mRNA表達水平檢測；48 h后再次收集細胞，用于免疫熒光及蛋白質印跡法（Western blotting）檢測。

1.2.2 動物實驗 將20只SD大鼠隨機分為4組，每組5只，分為假手術組、3 d模型組、7 d模型組、14 d模型組。各模型組UUO手術方法：術前8 h大鼠禁食禁水，以10%水合氯醛麻醉，消毒后由大鼠左側背部剪開皮膚，逐層分開肌肉，暴露左側腎臟，沿腎盂部位鈍性分離出左側輸尿管，于輸尿管中上1/3處以4-0線雙重結扎，切斷輸尿管。除不結扎及切斷輸尿管外，假手術組其他手術方法與模型組一致。于術后3、7、14 d處死大鼠，取腎組織，一部分保存于-80℃用于Western blotting檢測，一部分以10%甲醛固定后用于組化染色檢測。

1.2.3 組化染色檢測 10%甲醛固定腎組織標本經常規脫水、包埋、切片后行Masson染色，隨機選擇5個互不重疊的腎小管間質視野，200倍光鏡下觀察，統計組織膠原染色陽性面積占整個視野面積的百分比，進行半定量分析。半定量判定標準參照Banff定量標準[1]：陽性面積小于5%為0分；陽性面積5%～25%判為輕度病變（1分）；陽性面積26%～50%判為中度病變（2分）；陽性面積超過50%為重度病變（3分）。分別由2名經驗豐富的病理學專家獨立計分，計算均值。

1.2.4 實時熒光定量PCR檢測 提取收集到的HK-2細胞、腎組織總RNA，檢測RNA濃度及鑒定RNA質量后，按逆轉錄試劑盒說明書要求進行逆轉錄，取cDNA產物，按每孔100 ng cDNA進行實時定量PCR擴增；反應體系為：2×SYBR Green 10.0 μL，50×Dye 0.4 μL，10 μmol/L 上、下游引物各 0.8 μL，cDNA 2.0 μL，無菌雙蒸水補至20.0 μL；混勻、離心后上機檢測，反應條件為：95℃ 30 s，95℃ 5 s、60℃ 31 s循環 40次，分析融解曲線。β-actin擴增上游引物序列：5′-TCA GGT CAT CAC TAT CGG CAA T-3′，β-actin 擴增下游引物序列：5′-AAA GAA AGG GTG TAA AAC GCA-3′；ALR 擴增上游引物序列：5′-CAG AAG CGG GAC ACC AAG TTT-3′；ALR擴增下游引物序列：5′-CAC ACT CCT CAC AGG GGT AA-3′。每份標本重復檢測3次，每次設置3個復孔，計算均值作為最終結果；以β-actin為內參照物，采用2-△△t計算mRNA相對表達量。

1.2.5 Western blotting檢測 采用蛋白裂解液處理腎組織及HK-2細胞，提取總蛋白，嚴格冰上操作；二辛可酸法（BCA法）測定蛋白濃度；高溫變性后取20 μg蛋白樣品，采用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺電泳（SDS-PAGE）法，80 V恒壓電泳分離；將凝膠中的蛋白250 mA恒流轉移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上；以含5%BSA的Tris緩沖鹽及吐溫-20（TBST）緩沖液室溫封閉1 h，加入一抗4℃孵育過夜；洗膜后加入羊抗兔IgG二抗（1∶10 000）室溫孵育 1 h，電化學發光法（ECL）顯色；采用美國Bio-Rad公司Image Pro Plus 6.0軟件分析各條帶灰度值，計算均值作為最終結果。

1.2.6 細胞免疫熒光檢測 將制作好的細胞爬片以4%多聚甲醛固定30 min，0.3%Triton-X100室溫透膜5 min，山羊血清封閉30 min，兔抗人ALR多抗4℃孵育過夜；磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗，以FITC標記羊抗兔IgG二抗室溫孵育1 h；PBS清洗，60%甘油封片，采用熒光顯微鏡觀察ALR表達及分布情況。

1.3 統計學處理 采用SPSS19.0軟件進行數據處理和統計學分析。計量資料以±s表示，組間均數比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05為比較差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 TGF-β1對細胞E-cadherin、Vimentin表達水平的影響 Western blotting檢測結果顯示，與空白對照組相比，TGF-β1刺激后細胞E-cadherin蛋白表達水平明顯降低，Vimentin蛋白表達水平明顯增加（P＜0.05）；TGF-β1處理24 h后，不同劑量TGF-β1處理組間E-cadherin、Vimentin蛋白表達水平比較差異無統計學意義（P＞0.05），見圖1。

2.2 TGF-β1處理對EMT細胞模型23 kDa ALR表達水平的影響 TGF-β1處理12 h后，EMT細胞模型內源性23 kDa ALR mRNA表達水平較空白對照組明顯增加（P＜0.05），但不同劑量TGF-β1處理組間比較差異無統計學意義（P＞0.05），見圖2。Western blotting檢測結果顯示，EMT細胞模型內源性23 kDa ALR蛋白表達水平較低，TGF-β1處理48 h后，各處理組23 kDa ALR表達水平明顯增加，與空白對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05），見圖3。細胞免疫熒光檢測結果亦顯示TGF-β1處理可促進內源性23 kDa ALR蛋白的表達，以漿蛋白為主，見圖4。

圖1 Western blotting檢測不同劑量TGF-β1處理細胞E-cadherin及Vimentin表達水平

圖2 實時熒光定量PCR檢測不同劑量TGF-β1處理EMT細胞模型24 h后23 kDa ALR mRNA表達水平

圖3 Western blotting檢測不同劑量TGF-β1處理EMT細胞模型23 kDa ALR蛋白表達水平

2.3 腎臟組織Masson染色結果 UUO模型組腎小管結構嚴重破壞，管腔塌陷，大量炎性細胞浸潤，膠原成分明顯增加。模型組腎纖維化病理評分高于假手術組（P＜0.05），見圖5。

圖4 免疫熒光檢測不同劑量TGF-β1處理EMT細胞模型23 kDa ALR蛋白表達水平及分布（400×）

圖5 UUO模型大鼠不同時間纖維化程度及病理評分

2.4 UUO模型大鼠腎組織ALR蛋白表達水平 Western blotting檢測結果顯示，假手術組大鼠腎組織23 kDa ALR表達水平較低，UUO術后3 d和7 d梗阻腎組織23 kDa ALR表達水平增加，與假手術組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；與UUO術后7 d比較，術后14 d梗阻腎組織23 kDa ALR表達水平降低（P＜0.05），見圖6。

3 討 論

圖6 Western blotting檢測UUO模型大鼠腎組織23 kDa ALR蛋白表達水平

RIF是各種病因導致腎功能逐漸衰竭進展至終末期腎病（ESRD）的主要病理變化及共同病理途徑[9]。多種調控物質，包括生長因子、細胞因子、代謝毒素和應急分子等，通過復雜的機制和通路調節RIF進展過程。其中，TGF-β/Smad是公認的促進RIF最重要的細胞信號通路；TGF-β1可誘導腎小管上皮細胞發生EMT，促進成纖維細胞和肌成纖維細胞激活及聚集，從而發生RIF[10-12]。本研究結果顯示，TGF-β1 處理 HK-2 細胞可促進上皮細胞發生表型轉化，E-cadherin及Vimentin表達水平的改變，以及提高細胞內23 kDa ALR表達水平。有研究報道，ALR基因治療可通過減輕線粒體損傷、增加三磷酸腺苷酶（ATP酶）的活性、抑制氧化應激和下調TGF-β1等，保護肝臟不受四氯化碳（CCl4）誘導的損傷和纖維化[13]。本課題組前期實驗同樣證實ALR可減輕線粒體氧化應激損傷[7]。而本研究發現，增加的23 kDa ALR主要定位于線粒體內膜系統[4]。表達與線粒體內膜系統的23 kDa ALR可調節黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）連接的巰基氧化酶活性，催化二硫鍵的形成[14]，并作為一種電子轉移體存在于線粒體呼吸鏈。TGF-β1刺激后細胞23 kDa ALR表達增多，可能是通過增強細胞線粒體功能、增加ATP酶的活性，減輕TGF-β1刺激誘導的細胞表型轉化。

在UUO模型大鼠中，同樣觀察到類似結果。在病程的不同階段，內源性23 kDa ALR表達水平呈動態變化。在梗阻初期（術后7 d內），23 kDa ALR表達明顯增加，至梗阻14 d后，23 kDa ALR表達減少。大鼠模型誘導的梗阻性腎病涉及炎癥、氧化應激、脂質代謝、細胞凋亡、成纖維細胞增殖和活化等多種病理過程[15]。氧化應激導致的線粒體損傷及其介導的一系列代謝紊亂是梗阻性RIF的重要機制，其中氧化產物還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）及NADPH氧化酶（NOX4）在UUO術后第7天達到頂峰[16-17]。POLIMENO等[18]的研究發現，ALR能夠調節細胞氧化應激，降低活性氧的產生，發揮抗凋亡作用。因此，定位于線粒體的23 kDa ALR表達水平增加可能參與了梗阻性腎病時腎臟氧化應激過程，但具體機制仍不清楚。

綜上所述，本研究通過細胞和動物實驗證實了23 kDa ALR在RIF過程中表達增加，并在其中發揮重要作用，為進一步研究ALR在腎纖維化中的作用及尋找更好的治療措施奠定了一定的基礎。